这期开始将会系统的介绍一些生信初学者经常使用的工具，流程，敬请大家关注。首先今天和大家讲讲本地版的BLAST，一款作为生信工作者的你，这个是你每天都会用到的工具。这个网页版的blast估计你一定不会陌生吧？
基本介绍
BLAST是Basic Local Alignment Search Tool的缩写，直接翻译过来就是基本局部比对搜索工具。
常用的BLAST program有四个：
| 查询序列类型 | 数据库类型 | BLAST program |
|---|---|---|
| 核苷酸 | 核苷酸 | blastn: 使用核苷酸序列去搜索核苷酸数据库 |
| 核苷酸 | 蛋白质 | blastx: 使用核苷酸序列去搜索蛋白质数据库 |
| 蛋白质 | 核苷酸 | tblastn: 使用蛋白质序列搜索核苷酸数据库 |
| 蛋白质 | 蛋白质 | blastp：使用蛋白质序列搜索蛋白质数据库 |
实战如何使用blast寻找同源基因
科学家在鱼（Seriola quinqueradiata）中发现了一种与寄生虫（Benedenia）抗性相关的基因（C-凝集素）。我们实战的问题中的目标是在琥珀鱼(Seriola rivoliana)基因组中找到相应的基因。
首先，从NCBI下载Seriola rivoliana基因组
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/002/994/505/GCA_002994505.1_ASM299450v1/GCA_002994505.1_ASM299450v1_genomic.fna.gz
#unzip
gunzip GCA_002994505.1_ASM299450v1_genomic.fna.gz
获得C-凝集素蛋白质序列
vi benediniaGene.fasta
###将下面序列
>C-LECTIN
MKTLLILSVVLCAALSVRAAAVVPAEAATAQLGDKAAPEPEAVKDTAVEDTAVEETAVEDTAVEETAVEDTAVEETAVEDTAVEETAVEDTAVEDTAVEDTAVEDTAVEDTAVEETAVEDTAVEDTAVEDTAVAAGRPAGLRQTRLSFCLDGWQSFSGKCYFLANHPDSWANAERFCASYEGSLASVGSIWEYNFLQRMVKTGGHAFAWIGGYYFQGEWRWEDGSRFDY
SNWDTPRSTAYYQCLLLNSQVSMGWSNNGCNMNFPFVCQVRQLNC
创建基因组的核苷酸序列数据库
makeblastdb -in GCA_002994505.1_ASM299450v1_genomic.fna -dbtype nucl -input_type fasta -out SerRivdb
参数:
- -in：在这里，我们使用S. quinqueradiata基因组。
- -dbtype：我们希望生成的数据库类型，这里我们输入是核苷酸序列，选用nucl。如果是蛋白质序列作为输入，可以使用prot
-input_type：输入文件的类型（fasta）
-out：要生成的数据库的输出前缀
输出结果看起来像这样:
Building a new DB, current time: 08/03/2018 15:32:36
New DB name: /pylon5/mc48o5p/severin/Seriola/Rivoliana/SerRivdb
New DB title: GCA_002994505.1_ASM299450v1_genomic.fna
Sequence type: Nucleotide
Keep MBits: T
Maximum file size: 1000000000B
Adding sequences from FASTA; added 1343 sequences in 5.96571 seconds.
建库完成之后，我们要使用蛋白质序列对核苷酸数据库进行搜索，因此我们需要BLAST第中tblastn的program，其基本用法如下:
tblastn -db SerRivdb -query benedeniaGene.fasta -out blastout.txt
参数
- -db：由makeblastdb和参考fasta文件生成的基因组参考数据库
- -query：我们这里是要比对的蛋白质序列文件
- -out：你希望将结果输出的文件
默认OUTPUT结果
> PVUN01001342.1 Seriola rivoliana isolate HWSR04 Scaffold_1308,
whole genome shotgun sequence
Length=25273714
Score = 72.4 bits (176), Expect(2) = 3e-21, Method: Compositional matrix adjust.
Identities = 32/36 (89%), Positives = 33/36 (92%), Gaps = 0/36 (0%)
Frame = -3
Query 214 YFQGEWRWEDGSRFDYSNWDTPRSTAYYQCLLLNSQ 249
+ Q EWRWEDGSRFDYSNWDTP STAYYQCLLLNSQ
Sbjct 2542610 FLQDEWRWEDGSRFDYSNWDTPSSTAYYQCLLLNSQ 2542503
Score = 51.2 bits (121), Expect(2) = 3e-21, Method: Compositional matrix adjust.
Identities = 22/25 (88%), Positives = 23/25 (92%), Gaps = 0/25 (0%)
Frame = -2
Query 250 VSMGWSNNGCNMNFPFVCQVRQLNC 274
VS GWSNNGCNM FPFVCQVRQL+C
Sbjct 2542419 VSKGWSNNGCNMRFPFVCQVRQLDC 2542345
Score = 85.5 bits (210), Expect = 3e-17, Method: Compositional matrix adjust.
Identities = 39/54 (72%), Positives = 44/54 (81%), Gaps = 0/54 (0%)
Frame = -3
Query 163 LANHPDSWANAERFCASYEGSLASVGSIWEYNFLQRMVKTGGHAFAWIGGYYFQ 216
+ N S +RFCAS++GSLASV SIWEYNFLQRMVKTGGH FAWIGGYYF+
Sbjct 2543138 IKNKSSSPVVLQRFCASFDGSLASVRSIWEYNFLQRMVKTGGHKFAWIGGYYFE 2542977
为了输出更加简洁，这里调整一下输出的格式：
tblastn -db SerRivdb -query benediniaGene.fasta -outfmt '6 qseqid sseqid pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send evalue bitscore qcovs salltitles' -num_threads 16 -out blastout2.txt
这样每行每列都会按照你输出的格式来输出，blast结果有很多内容，但是我们一般重点关注e-value，比对上的长度 length 还有比对的相似度 pident。这里我们查看一下具有相似度50%以上的blast结果：
more blastout2.txt | awk '$3>50'
C-LECTIN PVUN01001342.1 88.889 36 4 0 214 249 2542610 2542503 3.15e-21 72.4 49 PVUN01001342.1 Seriola rivoliana isolate HWSR04 Scaffold_1308, whole genome shotgun sequence
C-LECTIN PVUN01001342.1 88.000 25 3 0 250 274 2542419 2542345 3.15e-21 51.2 49 PVUN01001342.1 Seriola rivoliana isolate HWSR04 Scaffold_1308, whole genome shotgun sequence
C-LECTIN PVUN01001342.1 72.222 54 15 0 163 216 2543138 2542977 3.04e-17 85.5 49 PVUN01001342.1 Seriola rivoliana isolate HWSR04 Scaffold_1308, whole genome shotgun sequence
C-LECTIN PVUN01001342.1 85.714 35 5 0 140 174 2543329 2543225 4.08e-11 67.0 49 PVUN01001342.1 Seriola rivoliana isolate HWSR04 Scaffold_1308, whole genome shotgun sequence
这样子你就可以找到C-LECTIN蛋白在琥珀鱼(Seriola rivoliana)基因组中同源相似的序列（在PVUN01001342.1上2542610bp位置附近)。然后你就可以基于这一段序列，做一些列下游的分析实验验证了。好了介绍差不多了，当然这里没有完全介绍完blast program的所有参数，这个大家可以去其帮助文档或者手册进行进一步的学习。对运行大批量的蛋白质或者核苷酸序列进行本地nt数据库的搜索，推荐大家可以使用将大块的序列切成小块，再通过并行运行来缩短运行的时间。
