1. 简介

自从通过疫苗接种消灭天花以来，疫苗大大减轻了全世界传染病的负担。近年来，流感和严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）等呼吸道感染的爆发引起了人们对全球大流行防范关注。然而，许多鉴定新疫苗的方法可能不在奏效。减毒活疫苗（可能存在安全问题）、灭活疫苗（需要持续传代）和亚单位疫苗（通常需要加强免疫或注射佐剂），病毒载体作为下一代疫苗平台，提供了一种便捷的疫苗抗原递送方法。

病毒作为疫苗载体有几个优点：病毒载体可以模仿自然感染，诱导针对编码抗原的强大免疫反应。每种疫苗的病毒载体疫苗的制造过程可以相同，只需更换编码外源抗原。自从第一个基于 SV40 病毒的病毒载体成功用于表达外源基因以来，许多其他病毒已被鉴定并设计成疫苗广泛应用，包括腺病毒（Ads）、腺相关病毒（AAV）、水疱性口炎病毒（VSV）和整合酶缺陷型慢病毒载体（IDLV）。预防人类传染性病原体如埃博拉病毒、HIV、流感、和 SARS-CoV-2。尽管如此，这些病毒载体仍然存在一些局限性。

副流感病毒 5 (PIV5) 是一种有包膜 RNA 病毒，属于副粘病毒科。 它于1956年首次从猿猴细胞中发现，因此被称为猿猴病毒5。2009病毒分类学认为 PIV5 能够感染人类和多种动物，包括狗、猫、仓鼠、豚鼠和牛。迄今为止，大量研究已经记录了 PIV5 载体是疫苗开发的良好系统。

2. PIV5的生物学特性

2.1 病毒基因组和病毒体结构

PIV5 是目前已知的副粘病毒科最小成员，是一种负义单链 RNA 病毒，其不分节基因组长度为15246个核苷酸 (nt)。从3′端开始，基因组编码8种蛋白质，分别是核衣壳蛋白(N)、V蛋白(V)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、小疏水蛋白(SH)、 血凝素神经氨酸酶 (HN) 和 RNA 聚合酶大蛋白 (L)。V 和 P 蛋白由单个基因 (V/P) 编码，并共享相同的起始密码子和 5' 编码区。它们的 3' 编码区不同，VmRNA是基因组序列的副本，而 P mRNA 是通过在转录结果中插入两个非模板鸟嘌呤核苷酸而创建的移码版本。 结果是 V 和 P 共享164个氨基酸残基的N 端结构域，但 C 端结构域不同（分别为 58 和 228 个残基）。 先前的研究表明，PIV5 SH不是病毒在组织培养细胞中生长所必需的。然而，SH 对于病毒在组织培养细胞中的生长是必需的。

2.2 PIV5毒株的基因组多样性

PIV5，最初命名为 SV5，首先从恒河猴和食蟹猴（食蟹猴）肾细胞中分离出来。 然而，随后的工作并未在野生猴子中发现任何针对SV5的抗体。PIV5现已从多种动物中分离出来，包括狗、猪、猫、老虎、穿山甲、马和小熊猫。系统发育分析结果表明，PIV5是一种全球性病原体，已多次从不同物种中分离到，且从同一动物物种中分离到的菌株表现出高度相似性。一些较早分离的菌株大多来自英国和美国，最新分离的L菌株来自中国。另外， 在表现出细胞病变效应（CPE）的 Vero 细胞中发现了俄罗斯 PIV5 毒株，怀疑这些细胞是被表现出轻微呼吸道症状的实验室技术人员意外污染的。

PIV5 毒株系统发育树

2.3 使用反向遗传学系统拯救重组PIV5病毒

自 20 世纪 80 年代以来，当第一个感染性 RNA 病毒克隆从cDNA中分离出来并生成脊髓灰质炎病毒时， 反向遗传技术和重组病毒设计已被广泛应用。1997 年，PIV5 通过采用反向遗传系统成功拯救。在该系统中，全长基因组序列和三个辅助病毒编码核衣壳和聚合酶蛋白（NP、P 和 L）的质粒被克隆为 cDNA，并处于 T7 RNA 聚合酶的转录控制之下。

3. PIV5 作为疫苗载体的优势

3.1 PIV5作为疫苗载体的安全性

尽管 PIV5 可以通过唾液酸残基结合来感染几乎所有哺乳动物细胞，但它不会产生导致宿主细胞损伤和死亡的典型 CPE (22)。PIV5 载体不包含致病基因，尽管宿主（包括许多动物物种）对PIV5敏感，但迄今为止没有足够的证据表明这些储存宿主的感染会引起典型的症状和疾病。 此外，PIV5 因为它在其生命周期中缺乏 DNA 阶段，重组或插入对宿主细胞 DNA 进行基因修饰的风险很小。

直观上，复制缺陷型载体比具有复制能力的载体具有更少的安全风险，因为复制能力的丧失阻止了疫苗在全身的传播。 基于此，近年来探索的平台之一是基于病毒样颗粒（VLP）的疫苗，它是多蛋白、自组装结构。虽然 VLP 疫苗的非复制性和非传染性特征使其成为更安全的替代品，但它们通常需要大剂量才能有效。为了解决这个问题，构建了包含 PIV5 复制子的 VLP，也称为扩增 VLP (AVLP)。它保留了 PIV5 的 RNA 转录/复制机制，而没有结构基因（M、F 和 HN），以允许连续外源基因在靶细胞中表达。此外，含复制子的 VLP 的生产也从之前的两步过程简化为一步过程。为了使 PIV5 载体成为更安全、更容易的候选疫苗，对载体的修改和生产工艺的改进仍在继续开发。

3.2 PIV5作为疫苗载体的稳定性

PIV5基因组结构是稳定的，因为与正链RNA病毒不同，PIV5不易发生基因缺失，并且病毒基因组稳定性对于病毒疫苗的安全性非常重要。 插入PIV5载体的外源基因经过11代Vero细胞传代，显示出良好的基因组序列和蛋白质表达（例如RSV F和G）稳定性。有趣的是，PIV5 病毒粒子具有高度多形性，直径大小范围为 100 至 200 nm。 这种结构的多功能性允许插入和容纳各种大小的外源基因。插入长度 >4 kb 的基因不会显着影响 PIV5 生长或病毒体完整性。此外，之前对 PIV3 病毒的研究表明，PIV3 载体最多可以表达三个外源基因，这意味着 PIV5 载体疫苗也可以表达 PIV3 病毒。

3.3 PIV5 载体疫苗的粘膜递送

目前有八种口服疫苗被许可用于对抗霍乱、沙门氏菌、脊髓灰质炎病毒和轮状病毒。减毒活流感疫苗是唯一获得许可的鼻内疫苗。 在批准用于人类的九种粘膜疫苗中，所有疫苗都是减毒活疫苗或全细胞灭活疫苗制剂。 转向使用病毒载体 RNA 和 DNA 疫苗可能会降低粘膜递送后过度反应原性的可能性。有效的疫苗应该产生中和抗体和组织驻留 T 细胞， 原则上，在粘膜部位诱导适应性免疫可以防止感染的发生，而不仅仅是减少感染和防止疾病症状的发展。鼻内治疗是一种有吸引力的方法，有可能触发肺部驻留 T 细胞和分泌性免疫球蛋白 (Ig)A。观察结果发现，对小鼠表达 PIV5 的病原体抗原进行鼻内免疫比肌肉注射提供了更好的保护，并且单剂量鼻内免疫可以诱导细胞免疫和中和抗体，并防止致命病毒的攻击。

PIV5疫苗载体构建

4. 基于 PIV5 的传染病候选疫苗

PIV5是开发不同传染病疫苗的优秀载体。 它已被设计为编码不同的抗原，作为许多病毒和细菌病原体的候选疫苗。

4.1 基于 PIV5 的冠状病毒疫苗

1960 年首次发现地方性冠状病毒感染。迄今为止，已发现七种可感染人类的冠状病毒，其中四种（HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43 和 HCoVHKU1）已知会引起轻度呼吸道症状。另外三种为严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和 SARS-CoV-2。目前，还没有针对 MERS-CoV 的批准疫苗。 然而，基于 PIV5 的针对 MERS-CoV 的候选疫苗 PIV5/MERS-S 在小鼠体内诱导了大量的中和抗体和强大的抗原特异性 T 细胞反应。此外，与灭活的MERS-CoV 疫苗接种动物相比，PIV5/MERS-S 免疫小鼠的肺部显示出较低的病毒负荷，并且没有明显的嗜酸性粒细胞浸润。在小鼠模型中，发现使用表达 MERS-CoV S 蛋白的 Ad5 或 Ad41 进行肌内免疫比胃内免疫能产生更好的保护。

持续的 COVID-19 大流行对疫苗产生了强烈需求。 上呼吸道是 SARS-CoV-2 感染的起始部位，它仍然是病毒复制的主要部位。在雪貂模型中，使用表达 SARS-CoV-2S 蛋白的 PIV5 进行单剂量鼻内免疫可提供针对致命 SARS-CoV-2 感染的保护，并阻止 SARS-CoV-2传播。

4.2 基于PIV5的流感病毒疫苗

流感病毒是一种负义、分段RNA病毒和，可引起严重症状和高死亡率。 根据其表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）作为主要免疫原性蛋白。该病毒分为18个HA亚型（H1-H18）和11个NA亚型 亚型 (N1–N11)。疫苗接种仍然是预防和控制流感病毒感染的主要工具。活病毒载体流感疫苗可以使重组病毒在接种宿主体内持续增殖，确保流感病毒抗原蛋白的高表达水平，从而在体内诱导特异性抗流感病毒免疫作用和/或非特异性先天免疫作用。

4.2.1 流感病毒HA作为抗原蛋白

第一个报道的表达流感病毒HA基因的PIV5载体的例子使用H3N2亚型病毒，并且该基因被插入到PIV5基因组的HN-L连接处。rPIV5-H3的复制水平与野生型PIV5相似，并且表达的HA蛋白被整合到病毒体中。

针对另一种流感病毒亚型（高致病性禽流感病毒 H5N1）的 PIV5 载体疫苗也有类似的发现。 此外，通过HA 基因被插入到 PIV5 基因组内的不同位置，以优化疫苗功效。 在 SH-HN 连接处插入 HA 基因的候选疫苗比使用其他插入位点的候选疫苗诱导了更大、更持久的保护反应。

与其他免疫途径（例如肌肉注射疫苗）相比，呼吸道粘膜途径越来越被认为是 PIV5 载体流感疫苗的首选途径。 通过粘膜给药疫苗具有优越功效的一种可能解释是在粘膜部位诱导适应性免疫，包括分泌抗体反应和组织驻留 T 细胞。 然而，肌肉注射 rPIV5-H5 疫苗的小鼠也能免受 H5N1 攻击，并且加强免疫可以显着增强保护性免疫反应。 因此，肌肉注射 rPIV5-H5 仍可用于保护患有哮喘或其他鼻内免疫禁忌症的个体。

先前的工作表明，删除PIV5中的SH基因和V基因的保守C末端会产生有助于诱导细胞凋亡的突变病毒（PIV5ΔSH和PIV5VΔC）。将 H5N1 HA 基因插入突变型 PIV5 载体中产生的候选疫苗（PIV5ΔSH-H5 和 PIV5VΔC-H5）与野生型 PIV5 载体产生的疫苗相比，提供了更好的保护。有趣的是，PIV5ΔSH-H5 诱导了最高水平的抗 HA 抗体和最强的 T 细胞反应，并且它可以保护小鼠免受致命的 H5N1 攻击，这些结果表明 PIV5ΔSH 是一种优越的疫苗载体。

4.2.2 通用流感疫苗的开发

尽管经过数十年的监测和定时干预，季节性流感病毒仍然每年在世界各地引起流行。 含有流感病毒HA基因的疫苗可有效预防季节性流感病毒（如H3N2）的传播，但必须定期更新，以跟上流行病毒的进化步伐。PIV5载体目前正被用来开发一种通用或具有广泛保护性的流感疫苗，用于针对新出现的流感病毒株的交叉生产。一项研究选择了四种甲型 H1N1 流感亲本毒株来代表不同的系统发育。在小鼠模型中评估了表达嵌合 HA 抗原的PIV5 载体疫苗的免疫原性。 结果数据显示，通过 PIV5 载体疫苗初免加强方案免疫的动物中，针对 ME08（用于评估交叉反应性的非亲本 H1N1 甲型流感病毒株）的疫苗诱导的 HA 反应性抗体水平显着较高。

同样，编码来自不同甲型流感病毒株 H5N1的NA基因的rPIV5毒株被生成，以评估它们作为流感病毒疫苗提供针对不同甲型流感病毒的保护的潜力。接种这两种候选流感疫苗中的任何一种都会在小鼠体内引发 NA 特异性抗体和 T 细胞反应。

与HA和NA蛋白相比，甲型流感病毒的核蛋白（NP）在所有甲型流感病毒株中高度保守，因此更适合用作通用流感疫苗开发的抗原。 科学家生成了含有 H5N1 NP 基因的 rPIV5 (PIV5-NP)，并评估了其保护功效。单次鼻内剂量的 PIV5-NP 可有效保护小鼠（50% 保护）免受 H5N1病毒（毒性最强的流感病毒）的致命攻击，并针对异亚型流感病毒的致命攻击提供完全保护（100% 保护）。尽管 PIV5-NP 是一种不完善的候选疫苗，但它比表达 VV 和 Ad5 的 NP（VV-NP 和 Ad5-NP）具有优势。

4.3 基于 PIV5 的 RSV 疫苗

RSV 是全世界儿科下呼吸道感染的主要原因，RSV 反复感染可导致婴儿、老年人以及免疫、心脏或肺系统受损的个体患上严重疾病。最近，Nirsevimab (Beyfortus)，一种单克隆抗体 针对 RSV 的抗体已获得英国监管部门的批准。但是仍然迫切需要发展主动免疫，为人类提供针对 RSV 的长效保护。 两种 RSV 蛋白，融合 (F) 蛋白和附着糖蛋白 (G)，与保护相关，它们是疫苗和抗病毒药物开发中最常见的蛋白。 关于 PIV5 载体 RSV 候选疫苗的病毒基因组稳定性，当 PIV5-RSV-F 或 PIV5-RSV-G 在 Vero 细胞中以高和低感染复数 (MOI) 传代 11 代时，尽管在 病毒在高 MOI 传代后的共有序列和低 MOI 传代下的较高突变率，这些突变都没有消除抗原表达。

rPIV5-RSV-F 或 rPIV5-RSV-G 鼻内免疫在小鼠模型中诱导了保护性免疫。同样，在棉鼠和非洲绿猴模型中，PIV5/F 或 PIV5/G 单剂量鼻内免疫产生了全身和局部免疫。 除了保护动物免受 RSV 挑战外，还具有免疫力。 这些疫苗还可以提高预先暴露于 RSV 的非洲绿猴体内的 RSV 中和抗体滴度。此外，在相同剂量水平下，PIV5/F 提供的保护优于 PIV5/G。为了进一步改进 PIV5/F 疫苗，插入位点更改为 SH-HN 连接处，或 PIV5 SH 被 RSV F 取代。单次鼻内施用 PIV5/F 疫苗不仅可以减少小鼠和棉鼠的 RSV 载量，还可以在小鼠和棉鼠中产生体液和细胞介导的免疫。重要的是，PIV5-RSV-F 在鼻内或皮下给药时具有同等的保护作用。 婴儿接种疫苗时优先采用皮下接种方法，因为鼻内接种可能会导致鼻塞。

最近，基于 VLP 的疫苗具有非复制性和非传染性，已被探索作为比减毒活疫苗更安全的替代候选疫苗。鉴于目标人群是 1 岁以下的婴儿，疫苗安全性尤其重要。 两种候选疫苗，表达 F 蛋白 (AVLP-F) 的 PIV5-AVLP 骨架或 RSV 转录因子蛋白 (M2-1) (AVLP-M2-1)，能够保护免疫小鼠免受 RSV 攻击。基于 PIV5 的 AVLP 系统有潜力成为 RSV 疫苗开发的更安全的平台。

5. PIV5 作为疫苗载体的挑战

尽管PIV5作为病毒载体对于开发针对不同传染病的疫苗具有许多优势，但其针对载体本身产生免疫力的能力可能是一把双刃剑。 例如，PIV5 载体可以是一种“自身佐剂”，这意味着它可以刺激宿主细胞中的先天免疫信号，从而激活先天免疫，而传统疫苗则需要额外的佐剂。先前的研究发现，表达 rPIV5 的 HA 在先前暴露于PIV5 的狗中具有免疫原性，这表明基于 PIV5 的疫苗可以克服预先存在的对 PIV5 的免疫力。同样，在小鼠模型中没有发现针对 PIV5 的中和抗体可以预防 PIV5 感染。细胞介导的免疫可能在消灭 PIV5 感染中发挥着关键作用。因此，在 PIV5 感染后，细胞介导的免疫可以有效应答之前有一段时间窗口，这为基于 PIV5 的疫苗复制和产生强大的疫苗提供了机会。

目前 PIV5 载体疫苗的生产过程非常耗时且产量相对较低。 包装和扩增步骤需要足够的时间。基于PIV5的疫苗的病毒滴度达不到AAV载体的病毒滴度，AAV载体最多可以产生1E14个基因组拷贝。/PIV5在这些储存宿主中的感染通常是无症状的，几乎没有安全问题； 然而，病毒载体的复制仍然引起人们的担忧，例如实验室污染和研究人员感染。 构建了两个基于 PIV5 的优化且更安全的平台（即 VLP 和含有复制子的 VLP），并且不能在受感染的细胞中产生后代。 这两种颗粒的封装效率值得进一步研究。 因此，建立高效、安全、可大规模生产并瞬时表达病原体抗原的平台将是PIV5载体疫苗的未来发展方向。