影响因子：6.208
本文属于单肿瘤分型思路，类似的分型文章我们也解读过很多。
肿瘤分型文章比较重要的结论就是分型后构建的评分能够预测免疫治疗或者其他治疗的疗效。
另外还有基于单细胞的分型分析
如果想做类似的分析，欢迎交流！
研究概述：
炎症肿瘤相关成纤维细胞（iCAFs）与膀胱癌（BCa）的进展、抗癌治疗耐药性和预后不良密切相关。本研究使用两个BCa scRNA-seq数据集，基于已报道的标志物COL1A1和PDGFRA，鉴定iCAFs并开发了278个标志物的相关特征。通过无监督共识聚类，以不同的癌症异常特征、免疫肿瘤微环境、预后、对化疗/免疫治疗的反应和干性为特征鉴定了两种TCGA-BLCA分子亚群。随后考虑到异质性，对iCAFs进行重新聚类，并鉴定出一个名为“LOXL2 + iCAFs”的亚群，最后进行LOXL2过表达/沉默CAFs与T24细胞共培养CM。该研究旨在增加我们对肿瘤促进和耐药分子机制的了解，有望帮助确定免疫治疗策略的新治疗靶点。
流程图：
研究结果：
一、scRNA-seq分析强调iCAF在BCa中的作用
如图1A所示，根据标记物COL1A1鉴定了10个簇，其中2个簇注为CAFs。根据先前报告的标记物（PDGFRA和RGS5）进一步鉴定了iCAF（聚类4）和mCAFs（聚类7）。
热图显示，CXCL14（一种免疫和炎症调节剂）仅在iCAF中上调，而收缩蛋白（TAGLN和MYL9）在mCAF中过表达（图1B）。
3.富集分析表明，iCAFs与细胞外基质组织和上皮细胞增殖有关（图1C上），而平滑肌细胞的局灶性粘附和调节主要富集在mCAF中（图1C下）。
4.GSEA表明，iCAFs（图1D上）和mCAFs（图1D下）分别上调了上皮-间充质转化和肌生成特征。以上总结：iCAFs亚型与BCa患者的进展和不良预后有关。
二、iCAF相关特征主导BCa炎症和免疫抑制TME
1.基于28个免疫相关特征的富集活性，通过无监督分层聚类识别3个免疫亚型，并将其定义为高、中、低免疫亚型(图S3A)。高免疫亚型与高免疫、基质和ESTIMATE评分及低肿瘤纯度相关(图S3B)，且 CD8+ T细胞和CD4+ T细胞，M1和M2巨噬细胞在该亚型中高度浸润，表明BCa中TME的异质性和复杂性(图S3C)。
2. iCAF特征评分从高免疫亚型逐渐下降到低免疫亚型（图S3B）。作者还推测iCAFs在BCa中塑造了促肿瘤表型的炎症TME。
- 由于复杂的免疫抑制信号网络，大量浸润的CD8+T细胞在TME中被称为“衰竭”。衰竭亚型的特征是抑制受体过表达和效应子功能差。进一步探讨发现衰竭T细胞与iCAFs之间呈强正相关(r = 0.77，图S3D)。
4. CD8+T细胞、Treg和M2巨噬细胞在BCa的TME中高度浸润，CAF相关评分高(图S3E)。综上推测iCAFs主导BCa的促肿瘤炎症和免疫抑制TME。
三、iCAF 相关特征将 BCa 分层为具有独特生物学特征的分子亚型
- 基于iCAF相关特征，通过无监督共识聚类鉴定了TCGA-BLCA的两种分子亚型（图2A）。亚型2辨别力较好，iCAF相关得分明显更高（图2B，C）。
2. iCAF 相关亚型具有不同的免疫基因组模式：亚型2与中/高免疫亚组有关，亚型1的特征是低免疫亚组（图2D）。亚型2具有高免疫/基质/ESTIMATE评分和低肿瘤纯度（图2E）。M2巨噬细胞在亚型2中高度浸润，树突状细胞和幼稚CD4 + T细胞在亚型1中高度浸润（图2F）
通过泛癌分析T细胞耗竭的异质性，确定了5个具有不同功能特性的衰竭T细胞亚簇，提出三个具有TEX特征的基因（RBM2，AXIN2和MSI2），这些基因在终末分化亚型中高度表达。作者分析了分子亚型中的三种亚型特异性制造商，发现亚型2与高表达水平相关（图2G），M2极化因子也上调（图2H）。
3. iCAF 相关亚型具有明显的失调途径：与亚型1相比，亚型2预后较差，基底/鳞状和腔内浸润亚型比例较高，腔内和腔内乳头状亚型比例较低(图3A,B)。此外，大多数与干性相关的特征在亚型2中上调(图3C)。
亚型2与EMT、TNF-α/NF-κB通路、IL-6/JAK/STAT3信号通路上调有关(图3D)。GSEA显示亚型2与趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK/STAT和PI3K/AKT信号通路有关(图3E)。
4. iCAF 相关亚型对免疫治疗和化疗有不同的反应：亚型2对抗PD1治疗的敏感性较低（图3F）。
四、与iCAF 相关的子类型在外部GEO 数据集中表现稳健
1.将来自GEO数据库的519名患者的七个独立的BCa数据集标准化为一个队列（图A）。
得到两个聚类(图B)，聚类1主要分为中/高免疫组(图C)。iCAFs与TEX之间的正相关验证了iCAFs在炎症性TME中的免疫抑制作用(r = 0.7，图D)。M2极化因子在聚类1中过表达(图E)。
2. icaf相关亚型预测BCa存活和分子亚型( 图F,G)。通路分析发现聚类 1上调的基因主要参与细胞因子调控、炎症反应和免疫调节(图H)。评估icaf相关亚型对治疗预测性能的响应发现：聚类2对抗pd1治疗和化疗更敏感(图I,J)。
五、ICI 治疗队列中 iCAF 相关亚型预测预后和免疫治疗反应
通过无监督共识聚类，把IMvigor210队列根据iCAF相关特征分为两个分子亚型。与亚型2相比，具有较高icaf相关特征评分的亚型1预测预后较差，免疫治疗应答率较低(图4A-C)。肿瘤突变负荷在亚型1中显著降低（图4D）。
六、LOXL2+ iCAF 预示预后不良
- 通过PPI网络分析，LOXL2被鉴定为iCAF相关特征的枢纽基因（图5A）。Pearson相关分析表明，LOXL2与iCAF相关评分呈显著正相关（r = 0.53，图5A）。此外，LOXL2的过表达预示预后不利（图5B）。
2. LOXL2过表达与M2巨噬细胞的高浸润水平有关（图5C）。高表达的LOXL2提示几种免疫疗法预测途径的富集评分较低（图5D）。
3.考虑到iCAFs的异质性，作者重新聚类iCAFs并成功识别出三个亚型。LOXL2仅在亚型2中过表达，与预后不良有关（图5E，G）。伪时间分析表明，亚型0 投影到根上，亚型1 和 2分别投影到两个分支上（图5 F），LOXL2 表达水平随轨迹树显著变化（图5H）。
- 分支点1起调节分化和基因表达谱的“检查点”作用，因此作者进行BEAM分析以鉴定分支依赖基因。结果表明，CXCL13、LOXL2、C7和APOD模块与iCAFs亚型2的发展方向呈正相关（图2I）。故此集群命名为“LOXL2+ iCAFs”。
七、CAFs中上调的 LOXL2 促进了 BCa 细胞的增殖、迁移和转移
与NF相比，LOXL2在CAF中内源性上调（图6A）。为研究LOXL2的生物学作用，分别通过质粒和siRNA进行功能增益和丧失，并通过qRT-PCR和WB测定验证其功效（图6B和图S7A）。
考虑到以LOXL2 + iCAFs为主的免疫抑制TME，在条件性LOXL2下评估了M2极化标志物CD206的CAFs-CM中的表达。免疫印迹分析显示，LOXL2的耗竭显著降低了CD206蛋白水平（图6F上）。相反，增强的LOXL2表达增加了蛋白质水平（图6F下）。
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共培养系统显示，在CAFs中过表达LOXL2促进了T24细胞的增殖（图6 C和图S7B），迁移（图6 D和图S7C）和侵袭（图6E和图S7D）；而沉默LOXL2则抑制。
图S7
- 为弄清由LOXL2过表达/沉默成纤维细胞衍生的CM调控T24细胞的机制，在CAFs中敲除LOXL2后处理RNA-seq（图6G）。IL32被确定为顶级DEGs中唯一的可溶性因子（图6G，H）。
5.GSEA显示细胞因子-细胞因子受体相互作用在LOXL2敲低的DEGs中富集（图6I）。在线工具GEPIA显示LOXL2和IL32之间存在正相关（r = 0.38，图6J）。ELISA表明IL32被LOXL2正调控（图6K和图S7E）。
研究总结：
在本研究中，整合的单细胞和批量RNA测序分析揭示了iCAF相关的特征，可以预测BCa免疫治疗的预后和反应。枢纽基因LOXL2的上调与M2巨噬细胞浸润和免疫治疗耐药有关，就抑制肿瘤进展和恢复治疗效果而言，抑制LOXL2可能是BCa治疗的一个有前景的靶点。
此外还发现iCAFs与干性之间的正相关关系，这表明iCAFs在癌症干性调节中的潜在作用。反过来，癌症干性通过塑造免疫抑制TME来挑战有效的治疗。因此，靶向iCAFs和破坏硬度可能是提高治疗效果的有吸引力的策略。
