首先来谈第一个距离分析

关于空间上细胞距离的分析，其实谈了很多了，大家可以参考我之前分享的文章空间转录组细胞类型的spot distance-based analyses，距离分析、空间转录组细胞类型的距离分析之二---代码实现，其实关于距离分析，其实就是研究细胞位置的动态变化，无论在发育，还是在肿瘤中都有非常高的价值，我们继续延伸一下这个分析的价值，以文章Integrative Analysis of Spatial Transcriptome with Single-cell Transcriptome and Single-cell Epigenome in Mouse Lungs after Immunization中的分析为例。

使用更新后的 scRNA-seq 数据和最终 15 种细胞类型，我们再次对四个切片中的每个点进行反卷积（单细胞空间联合的方法这里就不多讲了）。 箱形图总结了四个切片中 15 种细胞类型的比例（说白了分析细胞含量的变化）。 我们进行了 t 检验以比较免疫（切片 A1 和 A2）和再次攻击的小鼠（切片 A3 和 A4）之间的差异，发现每种细胞类型都有显着差异。 一般来说，单核细胞较多，再次攻击小鼠的巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞、Th1 细胞和 NK 细胞。 相比之下，免疫小鼠有更多的 B 细胞、Th17 细胞和其他 T 细胞。

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在汇集来自免疫切片（切片 A1 和 A2）或再次攻击的小鼠（切片 A3 和 A4）的spot后，计算比例矩阵列之间的 Pearson 相关系数。 在免疫小鼠和再次攻击的小鼠中发现了不同细胞类型的显着同点共存（上图B）。 对于免疫小鼠，Th17 细胞、单核细胞和内皮细胞倾向于出现在相同的位置。 树突细胞、B 细胞、成纤维细胞和其他 T 细胞 1 也彼此接近（空间距离）。 对于再次攻击的小鼠，其他 T 细胞 1、B 细胞、Th17 细胞、Th1 细胞和树突细胞经常出现在相同的位置。 虽然 Th1 细胞、NK 细胞和骨髓细胞在体内可能彼此接近。 每个切片单独分析后，这些观察结果保持不变（下图）。

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气道和血管的定位和分割在分析中很重要。 根据club cells和组织学血管的比例定义了气道和血管（下图）。

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在排除血管内的spot和与气道距离超过 1,000 微米的spot后，我们根据公式计算了 Th17 和 Th1 细胞与气道的加权距离（下图）。

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在再次攻击的小鼠中，发现 Th17 细胞比 Th1 细胞更靠近气道，而 Th1 细胞更靠近免疫小鼠的气道（下图）。

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该结论与气道和血管的定义无关，因为即使使用一组临界值来定义这些结构，它也保持不变（下图）。

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为了找到免疫细胞的空间分布模式，进行natural spline regression（关于回归样条，大家可以参考文章回归样条）以拟合免疫细胞比例与气道距离之间的非线性关系。通常，B 细胞和其他 T 细胞靠近免疫小鼠的气道，而中性粒细胞位于再次攻击小鼠的气道远端（图 4Ei-iv）。

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还对所有 15 种细胞类型进行了相同的分析（下图）。

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在基因表达与气道距离之间进行了natural spline regression。在免疫小鼠中鉴定出 3,655 个距离相关基因（两个切片中 FDR 调整的 P 值 < 0.05），而在再攻击小鼠中鉴定出 3,407 个。对这些距离相关基因进行了基因 (GO) 富集分析。免疫小鼠有 1,293 个显着（FDR 调整 P 值 < 0.05）过度表达的生物过程被识别，1,294 个通路被再次攻击的小鼠识别。重新攻击小鼠的前 50 名（按倍数富集分层排序）过度代表的生物过程包括许多免疫反应（例如，免疫细胞的增殖、分化、激活、聚集、粘附和趋化性）。相比之下，在免疫小鼠中几乎没有过度表达的免疫反应。 Ccl20 是一种顶级距离相关基因，在再次攻击的小鼠而非免疫小鼠的气道周围高度表达（下图）。

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由于 CCL20 能够与 CCR6（一种在 Th17 细胞上表达的趋化因子受体）结合，这一发现可能解释了为什么 Th17 细胞比再次攻击的小鼠中的 Th1 细胞更靠近气道。

我们来看看具体的做法

对于所有基于距离的分析，定义为血管的spot和与气道的距离超过 1,000 微米的spot被排除在外。由于血管内的细胞与肺实质中的细胞不同，而且包括气道极远侧细胞在内的分析不稳定，因为每个切片的捕获面积仅为 6.5 x 6.5 mm²。只有少数spot与气道的距离超过 1,000 微米（切片 A1 为 5.89%，切片 A2 为 5.75%，切片 A3 为 15.00%，切片 A4 为 11.43%）。

Th17 和 Th1 细胞到气道的加权距离根据公式计算在四个切片中，考虑到每个spot到最近气道的距离以及每个点中 Th17 和 Th1 细胞的比例。为了找到细胞类型的空间分布模式，进行了自然样条回归（具有三个自由度）以拟合细胞类型比例与气道距离之间的非线性关系。

为了识别距离相关基因，为每个切片中到气道的距离构建了自然样条（具有三个自由度）并创建了设计矩阵。然后，我们在标准化基因表达矩阵中为每个基因拟合线性模型，并调用 R 包 limma以加快过程。使用 Benjamini-Hochberg 校正对每个切片中每个样条的 P 值进行多次测试校正。对于至少一个样条，其 FDR 调整 P 值 < 0.05 的基因被认为在该切片中是显着的。将免疫切片（切片 A1 和 A2）或再次攻击的小鼠（切片 A3 和 A4）的两个切片中的显着基因定义为距离相关基因。

接下来谈第二个问题，空间通讯的问题，其实关于空间的通讯分析，之前也分享了很多了，大家可以参考文章10X空间转录组做细胞通讯的打开方式、空间通讯分析章节2、10X空间转录组通讯分析章节3等等，就不给大家一一列举了。

为了进行细胞间通讯网络分析，根据细胞类型比例的等级确定了细胞类型富集点（下图，空间位点注释）

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同一小鼠的两个切片之间几乎没有差异（下图）。

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由于难以解释与它们的相互作用，成纤维细胞、内皮细胞和红细胞未包括在分析中。

使用 CellChat（下图）

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在每个切片中推断出细胞类型富集点之间的细胞间通讯网络。 为了比较再次攻击和免疫小鼠之间通信模式的差异，热图显示了细胞类型富集点之间的不同相互作用强度（下图）。

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在再次攻击的小鼠中，骨髓细胞、Th1 细胞和 Th17 细胞之间的交流增加，我们的同点共现分析（这个分析就是共定位分析）也揭示了这一点。 对于免疫小鼠，树突状细胞可能是通信信号的主要发送者，而 B 细胞和其他 T 细胞是信号的重要接收者。

保守的和上下文特定的信号通路通过条形图被识别和可视化（下图）。

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TNF通路仅在再次攻击的小鼠中开启，而CXCL和CCL通路增加。在空间转录组的细胞-细胞通讯分析中确认了一些众所周知的信号通路，优于scRNA-seq数据的细胞-细胞通讯分析。随着空间转录组学分辨率的发展，这种分析的性能可能会更好。我们发现再攻击小鼠的 Th17 富集点是 IL6 信号通路的接收者，因为受体基因 Il6ra 在切片 A3 和切片 A4 的 Th17 富集点中高度表达（下图）。

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利用 scATAC-seq 数据，我们确认巨噬细胞和树突细胞是 IL6 信号的来源，而 Th17 细胞是靶标。对于 TGF-β 信号通路，我们还发现再次攻击小鼠的 Th17 富集点是其受体，受体基因 Tgfbr1、Tgfbr2 和 Acvr1b 在切片 A3 和切片的 Th17 富集点中高度表达A4（下图）。

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通过检查这些受体基因周围基因组区域的峰值，证实 Th17 细胞具有表达 TGF-β 信号受体的能力。这些数据表明，空间转录组学数据可以外推并用于进行细胞间通讯网络分析。

看看具体的做法

使用 CellChat进行细胞间通讯分析。 在运行 R 包 CellChat之前，处理了四个切片的空间转录组，使用归一化的基因表达矩阵，提取细胞类型富集点的注释并保存在 CellChat对象中。 来自免疫（切片 A1 和 A2）或再次攻击小鼠的两个切片的处理数据也汇集在一起并保存在 CellChat对象中，以比较两只小鼠之间的差异。

加载了人工管理的小鼠配体-受体相互作用数据库进行分析。 所有配体-受体相互作用，包括旁分泌/自分泌信号相互作用、细胞外基质 (ECM)-受体相互作用和细胞-细胞接触相互作用，都包括在分析中。 （cellchat自身的数据库）。

首先为每个 CellChat 对象中的每种类型的细胞类型富集点鉴定显著表达的配体或受体。如果配体或受体显著表达，也可以鉴定显著表达的配体-受体相互作用。然后，我们根据默认设置计算通讯概率并推断cellular communication network。通过总结与每个信号通路相关的所有配体-受体相互作用的通讯概率来计算信号通路水平的通讯概率。通过计算链接数或汇总通讯概率计算聚合的细胞 - 细胞通信网络并在四个切片中进行可视化

使用热图。

为了弄清楚在再次攻击的小鼠与免疫小鼠中哪种类型的细胞类型富集点相互作用发生了显着变化，使用热图识别并可视化了不同的相互作用强度。通过比较每个信号通路的信息流来识别保守的和上下文特定的信号通路，这是由网络中的总权重定义的。使用 CellChat netVisual_aggregate 函数通过圆形图显示选定的信号通路（cellchat的默认函数都可以实现）。

最后补充一个分析，Same-spot Co-occurrence Analysis

在每个切片中计算比例矩阵的列（表示不同的细胞类型）之间的 Pearson 相关系数，以广泛评估同一地点的空间细胞类型共存。 将免疫切片（切片 A1 和 A2）或再次攻击的小鼠切片（切片 A3 和 A4）中的斑点分别合并在一起，还计算了它们的 Pearson 相关系数。 相关 r 矩阵分层聚类并在热图中可视化（下图）。

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