文献：< Suppressing the DSCAM/PAK1 pathway reverses neurogenesis deficits in Down Syndrome patient iPSC-derived cerebral organoids >
第一单位：南京医科大学
发表期刊：J Clin Invest
影响因子：11.864
研究背景
唐氏综合症（DS），是由21号染色体三倍体引起的，是导致出生缺陷和认知异常最常见的遗传原因，每800例活产中就有1例发生。
DS特征包括：大脑重量减轻、脑萎缩、皮质变薄、神经发生受损、皮质分层改变、神经前体细胞（NPCs）增殖受损和神经发生减少等。尽管在过去的二十年中积累了关于DS神经发育的知识，但是DS皮质发育受损的机制仍然不清楚。
唐氏综合症细胞粘附分子（DSCAM）编码一种细胞粘附分子，参与神经元的生成、成熟、树突形态和神经元布线。
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DSCAM基因的三倍性，解除了PAK1和pPAK1的活性。PAK1是DSCAM的下游基因，通过调节神经祖细胞的增殖，在皮层发育中发挥作用。
然而，目前尚不清楚DSCAM-PAK1通路是否调控DS患者大脑皮层的发育。
研究结果
1. scRNA-seq显示21三倍体类器官神经发育发生改变
从三个DS患者的三个iPSC细胞系（DS1、2DS3和DSP）、三个整倍体iPSC细胞系（IMR90-4、ihtc-03和DS2U）和一个hESC细胞系（H9）生成类器官（图1A）。与整倍体类器官相似，21三倍体类器官显示区域化和皮质层（图1B-D）。
- 对第30天和70天的大脑类器官，进行scRNA-seq（7个hPSC细胞系，n=65342个细胞），总共注释到8种主要的细胞类型（图1E）。
- 使用VoxHunt算法，将scRNA-seq数据映射到Allen Brain Atlas的3D原位杂交数据上，发现大脑类器官中的簇高度映射到胚胎期（E）13.5小鼠大脑的背侧前脑（图1F）。
- 通过比较每个簇中细胞的比例，作者发现，细胞系和组间的细胞多样性是相似的。
拟时序分析和亚群分析显示，发育阶段分类与拟时间正相关，而与整倍体30天的发育状态相比，21三倍体类器官祖神经元的发育轨迹出现了延迟（图1H和I）。 - GO和pathway分析显示，所有簇之间的差异基因（DEGs）在神经发生、前脑发育和神经前体细胞增殖等生物过程中富集（图1J）。
综上所述，这些数据表明，与整倍体器官相比，DS大脑类器官的神经发育表现出显著的改变。
2. 染色质开放性受损是来源于三倍体iPSC的大脑类器官转录受损的基础
总的来说，DS中染色质可及性的分布保持不变。
- 然而，在DS的21号染色体的启动子区域，观察到染色质可及性显著增加（图2A和B）。
- 其他染色体上的许多区域，在可及性方面也显示出显著的变化，与来自整倍体iPSCs的器官相比，来自三倍体iPSCs的器官中有1785个上调的区域，1695个下调的区域（图2C）。
其中，三倍体样本中染色质开放区相关的marker基因PAX6, GLPER, PTCH1, LMO1, VCAM1和NT7A的启动子区开放性降低。 - 通过鉴定三倍体和整倍体特异开放区富集的转录因子motif，作者发现很多受SOX2、lsl1和Rfx5调控的基因在三倍体样本中开放性降低，在差异染色质开放区附近的基因富集在神经发生和神经系统发育中。
为了检验染色质可及性的破坏是否会导致转录组的改变，对两组第30天的大脑类器官进行RNA-seq，得到104个表达上调基因和91个表达下调基因（图2D）。
与scRNA-seq结果相一致，RNA-seq的差异基因，主要富集在神经发育、细胞增殖和神经发生通路中。值得注意的是，参与调节增殖的Ki67和PAX6在三体类器官中的表达降低。
对联合分析得到的基因进行GO分析，发现它们在中枢神经系统神经元分化、神经元迁移和谷氨酸受体信号通路等生物过程中富集（图2F）。综上所述，这些结果表明，至少有一部分DS的转录组学改变与邻近染色质的可及性改变有关。
3. NPCs增殖减少导致DS来源的皮质类器官体积变小
为了验证在RNA-seq数据中观察到的神经病理学表型，作者对DS和对照类器官的增殖进行了比较。
- 与第7天的整倍体胚胎相比，三倍体胚胎的周长缩短（图3A和B）。
- 此外，21三倍体类器官比整倍体类器官明显更小，并且膨胀率明显降低（图3C和D）。
- 为了进一步检查第30天21三倍体类器官的异常结构，作者评估了三倍体和整倍体类器官中神经上皮环的结构，包括顶膜和基膜的长度、环的直径、脑室样区的大小、环的总面积和环的组织面积（图3E）。结果发现，与整倍体类器官相比，21三倍体类器官的所有参数都有所降低（图3F-K）。
- 为了测试VZ NPC的增殖改变是否会延迟三倍体类器官扩张，在分化起始30天后，测定VZ样区域中的 Ki67+, EdU+ and PAX6+ 细胞比例（图4A-C；图4E-G）。
- 作者还发现，不仅三倍体皮质VZ样区域的增殖明显减少，而且这个区域的SOX2+祖细胞也较少（图4D和H），而凋亡marker的表达在同一时间点没有明显改变。
这些结果表明，三倍体NPCs的增殖减少是21三倍体类器官变小的原因。
接下来，使用分化后50天的有效标记物，来评估皮层神经元不同亚型的生成。
为了进一步研究DS的后期发育阶段，作者对第70天的大脑类器官进行了scRNA-seq和组织学分析（图5A）。
- 对谷氨酸能神经元亚群的UMAP可视化显示，在21三倍体类器官中，皮质成熟深层和成熟上层神经元的组成显著减少（图5B和C）。
- 此外，在三倍体谷氨酰胺能神经元中，表达皮质上层marker BRN2和SATB2的细胞比例降低（图5D）。
- 组织学结果显示，在DS来源类器官中在第70天时，CTIP2+和SATB2+细胞比例显著降低，与基因表达谱结果一致（图5E-H）。
总之，这些结果表明，增殖减少可能有助于减少21三倍体类器官的神经发生。
敲低****DSCAM****基因可以逆转DS类器官的增殖缺陷
通过qPCR作者发现21三倍体细胞中的DSCAM表达增加（图6A）。同时，21三倍体类器官DSCAM 染色质开放性也增加（图6B），DS中DSCAM的蛋白水平也显著高于对照组（图6D和F）。PAK1位于DSCAM下游，调控神经祖细胞的增殖和突触可塑性，这促使作者对PAK1的表达水平进行研究。qPCR分析显示三倍体细胞中PAK1 mRNA水平高于整倍体对照细胞（图6C），这与观察到的蛋白质水平一致（图6D和G）。此外，与整倍体类器官相比，DS类器官中磷酸化PAK1 （p-PAK1）的蛋白水平显著升高（图6E和H）。这些结果表明，DSCAM-PAK1通路在21倍三体类器官中发生了改变。
作者假设，体外观察到的DS神经发生缺陷是由于DSCAM及其下游蛋白PAK1表达改变所致。为了验证这一假设，作者利用CRISPR/Cas9基因组编辑方法，从DS1 iPSC细胞系建立DSCAM-KD iPSC（图6I），然后分化DS和编辑的iPSC细胞系为大脑皮质类器官（命名为DSCAM-KD2-1-6和DSCAM-KD2-1-12）。分化诱导后30天DSCAM-KD大脑类器官的scRNA表达谱显示，在三倍体方面，DSCAM-KD类器官和整倍体类器官的表达变化呈正相关，这表明DSCAM-KD中转录组的成功恢复（图6J）。此外，DSCAM-KD组DS中下调基因的平均表达水平恢复到与整倍体组相似的水平（图6K）。进一步分析表明，与DS1大脑类器官相比，DSCAM-KD大脑类器官亚群中DSCAM的平均表达水平显著下调（图6L）。
具体而言，与DS1组相比，DSCAM-KD组中DSCAM、PAK1和p-PAK1的蛋白表达水平降低（图6M-Q）。这些结果证实了DSCAM-KD2-1-6和DSCAM-KD2-1-12组DSCAM的有效敲除，RNA和蛋白质水平均显著且一致地降低。此外，还观察到与DS1类器官相比，DSCAM-KD类器官的所有参数都有部分恢复。
接下来，作者研究了降低DS1类器官中DSCAM基因的表达是否可以挽救背侧神经祖细胞的增殖缺陷。所有结果表明21三倍体类器官的增殖和神经发生缺陷可以通过调节DSCAM基因来挽救。
FRAX486****挽救DS类器官的异常增殖和神经发生
考虑到DSCAM-PAK1通路参与神经发育并在DS中发生改变，作者研究了是否可以通过应用小分子靶向这个通路来挽救这些缺陷（图8A）。发现用FRAX486（一种调节PAK1磷酸化的抑制剂）预处理DS1类器官，可以降低p-PAK1的蛋白水平（图8B和D），而不改变总PAK1的表达水平（图8C和E）。作者还测试了FRAX486对PAK1的抑制是否能改善DS类器官的神经发生缺陷，发现在异常的神经上皮环结构中观察到部分挽救（图8F和G）。FRAX486在分化30天后有效地增加了NPC的增殖（图8H和I）。此外，通过FRAX486处理抑制PAK1，随后增加了CTIP2（分化开始后50天）和SATB2（分化开始后70天）的表达，表明神经发生得到挽救（图8 J-M）。
本研究建立了3D大脑器官样培养来研究DS患者大脑发育异常的相关机制。通过scRNA-seq分析揭示了DS的细胞类型特异性分子病理学。数据显示，DS-iPSC来源的大脑类器官部分重现了在DS小鼠模型和死后DS大脑样本中观察到的异常，包括增殖率降低和神经发生异常。此外，还发现通过敲除三个DSCAM等位基因的一个位点，可以逆转DS类器官的皮质变薄和增殖缺陷。同样，小分子抑制剂FRAX486通过调节PAK1的表达，可以挽救神经病理表型。本研究的发现可能为DS的产前干预提供一个潜在的靶点。
