前言
本文并非原创，来自多篇博文摘录。
第一节 NGS测序技术
在真正开始数据分析之前先知道我们是如何将那些原本存在于细胞中的DNA信息获取出来的——也就是测序的原理，总是有益的。
测序，简单来说就是将DNA化学信号转变为计算机可处理的数字信号。
它从1977年的第一代Sanger技术发展至今，已经足有40年时间。在这个技术发展的更迭历程中，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看第二代短读长测序技术在全球范围内上占有着绝对的垄断位置，但第三测序技术也已在这几年快速地发展着。测序技术的每一次变革和突破，都对基因组学研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。所以在这个系列的第一篇里我将对当前最主流的测序技术以及它们的测序原理做一个全面的介绍。
图1. 测序技术发展历程
第一代测序技术
第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，由桑格老人家测定了第一个基因组序列——噬菌体phiX-174，全长只有5,375个碱基。虽然与今日的技术比起来根本不算什么，但自此之后，人类获得了窥探生命本质的能力，并以此为开端真正步入了基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为基础进行测序的。Sanger法的核心原理是：由于ddNTP（4种带有荧光标记的A,C,G,T碱基）的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA的合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分别为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），然后利用凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个Sanger测序法短片为Sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。
值得注意的是，在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、连接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID使用的测序方法，但他们的核心手段都是利用了Sanger中可中断DNA合成反应的dNTP。
第二代测序技术
总的来说，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1,000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa/HiSeq技术和ABI公司的SOLID技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术在大幅提高了测序速度的同时，还大大地降低了测序成本，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但其序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。图3. 是第一代和第二代测序技术测序成本作了一个简单的比较，可以看出自第二代测序技术发展出来之后，历史开始发生根本性的改变，测序的成本开始快速实现断崖式下降，也就是业内经常提到的 超摩尔定律 现象。
图3. 测序成本比较（来源：NIH网站）
illumina
目前illumina的测序仪占全球75%以上，以HiSeq系列为主。它的机器采用的都是边合成边测序的方法，主要分为以下4个步骤：
图4. illumina测序原理（来源：illumina官网）
1）构建DNA测序文库，图4-1
简单来说就是把一堆乱糟糟的DNA分子用超声波打断成一定长度范围的小片段。目前除了一些特殊的需求之外，基本都是打断为300bp-800bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头【注】，构建出单链DNA文库，以备测序之用；
【注】接头在illumina中一般分为P5和P7接头，其中一个带有和flowcell上的探针反向互补的序列，以完成待测序列和探针结合的作用，另外一个接头带有barcord序列以区分不同的样本。
2）测序流动槽（flowcell），图4-2
flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，也是核心的测序反应容器——所有的测序过程就发生在这里。当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的槽道（称为lane）上。每个flowcell有8个lane（图5），每个lane的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对，这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因，并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增，理论上这些lane之间是不会相互影响的。
3）桥式PCR扩增与变性
图6. 桥式PCR扩增（来源：illumina官网）
这是NGS技术的一个核心特点。桥式PCR以flowcell表面所固定的序列为模板，进行桥形扩增，如图6所示。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，这一过程的目的在于实现将单一碱基的信号强度进行放大，以达到测序所需的信号要求。
4）测序，如图4-4和图7所示
测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP，这就确保了在测序过程中，一次只会被添加一个碱基。同时在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号（图7），并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。
Illumina的这种每次只添加一个dNTP的技术特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在1%-1.5%左右。测序周期以人类基因组重测序为例，30x-50x测序深度对于Hisq系列需要3-5天时间，而对于2017年初最新推出的NovaSeq系列则只需要40个小时！
Roche 454
Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。它的主要测序原理是（图8 abc）2：
（1）DNA文库制备
Roche 454测序系统的文件构建方式和illumina的不同，它是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增，连接载体，构建单链DNA文库（图5a）。
**（2）Emulsion PCR **（乳液PCR，其实是一个注水到油的独特过程）
454当然DNA扩增过程也和illumina的截然不同，它将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。
乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”（水包油），基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。
这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列，因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，所以保证了每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩增，并且扩增产物仍可以结合到磁珠上。当反应完成后，可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。进过扩增，每个小片段都将被扩增约100万倍，从而达到下一步测序所要求的DNA量。
（3）焦磷酸测序
测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，接着将磁珠放在一种PTP平板上。这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法来固定每个磁珠的位置，以便检测接下来的测序反应过程。
测序方法采用焦磷酸测序法，将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光，同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录，最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果。由于每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来判断被测分子的序列。反应结束后，游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP，从而导致荧光淬灭，以便使测序反应进入下一个循环。由于454测序技术中，每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行，因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。454技术最大的优势在于其能获得较长的测序读长，当前454技术的平均读长可达400bp，并且454技术和illumina的Solexa和Hiseq技术不同，它最主要的一个缺点是无法准确测量同聚物的长度，如当序列中存在类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，而所加入的T的个数只能通过荧光强度推测获得，这就有可能导致结果不准确。也正是由于这一原因，454技术会在测序过程中引入插入和缺失的测序错误。
Solid技术
Solid测序技术是ABI公司于2007年开始投入用于商业测序应用的仪器。它基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序（图6）2,4。它的原理是：
（1）DNA文库构建
片段打断并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。
（2）Emulsion PCR
Solid的PCR过程也和454的方法类似，同样采用小水滴emulsion PCR，但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有1um。在扩增的同时对扩增产物的3’端进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。3’修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域（图6-a）。Solid系统最大的优点就是每张玻片能容纳比454更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。
（3）连接酶测序
这一步是Solid测序的独特之处。它并没有采用以前测序时所常用的DNA聚合酶，而是采用了连接酶。Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，这里将其简单表示为：3’-XXnnnzzz-5’。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针的5’末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料（图6-a）。这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的荧光标记。这是Solid的独特测序法，两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基。这种测序方法也称之为两碱基测序法。当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会发出代表第1，2位碱基的荧光信号，图6-a和图6-b中的比色版所表示的是第1，2位碱基的不同组合与荧光颜色的关系。在记录下荧光信号后，通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割，这样就能移除荧光信号，以便进行下一个位置的测序。不过值得注意的是，通过这种测序方法，每次测序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位……在测到末尾后，要将新合成的链变性，洗脱。接着用引物n-1进行第二轮测序。引物n-1与引物n的区别是，二者在与接头配对的位置上相差一个碱基（图6-a. 8）。也即是，通过引物n-1在引物n的基础上将测序位置往3’端移动一个碱基位置，因而就能测定第0、1位和第5、6位……第二轮测序完成，依此类推，直至第五轮测序，最终可以完成所有位置的碱基测序，并且每个位置的碱基均被检测了两次。该技术的读长在2×50bp，后续序列拼接同样比较复杂。由于双次检测，这一技术的原始测序准确性高达99.94%，而15x覆盖率时的准确性更是达到了99.999%，应该说是目前第二代测序技术中准确性最高的了。但在荧光解码阶段，鉴于其是双碱基确定一个荧光信号，因而一旦发生错误就容易产生连锁的解码错误。
第三代测序技术
这是一个新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序技术为标志，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，最大的特点就是 单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，超长读长，以下图9是PacBio SMRT技术的测序读长分布情况，平均达到10Kb-15Kb，是二代测序技术的100倍以上，值得注意的是在测序过程中这些序列的读长也不再是相等的，下文有解析！
PacBio SMRT
PacBio SMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体（如同flowcell）。基本原理是： DNA聚合酶和模板结合，用4色荧光标记A,C,G,T这4种碱基（即是dNTP）。在碱基的配对阶段，不同的碱基加入，会发出不同的光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。
这个DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。PacBio SMRT技术的一个关键点是在于如何将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来。他们利用的是ZMW（零模波导孔）原理：如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔。这些小孔的直径是有严格要求的，如果直径大于微波波长，能量就会在衍射效应的作用下穿透面板从而泄露出来（光波的衍射效应），从而与周围小孔相互干扰（光波的干涉）。如果孔径能够小于波长，那么能量就不会辐射到周围，而是保持直线状态，从而可起到保护的作用。同理，在一个反应管(SMRTCell:单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔,，即 ZMW(零模波导孔)，外径100多纳米，比检测激光波长小(数百纳米)，激光从底部打上去后不会穿透小孔进入上方的溶液区，能量会被限制在一个小范围(体积20X 10-21 L)里（图10-A），正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅仅只是来自于这个小反应区域，孔外过多的游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景噪音降到最低的目的。
PacBio SMRT技术除了能够检测普通的碱基之外，还可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测碱基的表观修饰情况，如甲基化。因为假设某个碱基存在表观修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，那么相邻两峰之间的距离会增大，我们可以通过这个时间上的差异来检测表观甲基化修饰等信息（图11）。
SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但这么快的测序速度也带来了一些明显的缺点——测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），可以达到10%-15%，而且以缺失序列和错位居多，但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在一定的碱基偏向，因此可以通过多次测序来进行有效纠错。
Oxford Nanopore
Oxford Nanopore 的MinION是另一个比较受关注的第三代测序仪，俗称U盘测序仪，图12（左）！这家公司开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术相比都不一样，它是基于电信号而不是光信号的测序技术！
这个技术的关键点在于他们所设计的一种特殊纳米孔，孔内共价结合分子接头。当DNA分子通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），最后高灵敏度的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基（图13）。
纳米孔测序以及其他第三代测序技术，有可能会彻底地解决目前第二代测序平台的诸多不足。另外，MinION的主要特点是：读长很长，而且比PacBio的都长得多，基本都是在几十kb上百kb以上，最新的数据显示可以达到900 kb！错误率是5%-15%，也是随机错误，MinION最大的特点除了极小的体积之外，就是数据将是可实时读取的，并且起始DNA在测序过程中不被破坏！这真是个可以上天的能力。然鹅，遗憾地多说几句，目前还没真正公布，细节也不知，自从2012开过一次发布会之后，就没什么声响了。
这种纳米孔单分子测序仪还有另一大特点，它能够 直接 读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代测序方法那样需要事先对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。下面是对PacBio和Oxford Nanopore这两家第三代测序技术公司的测序仪做的一个简单比较，可以看出其实成本还是蛮高的，质量也只是还行，期待他们的下一次进化吧。
总结
以上，便是对各代测序技术的原理做了简要的阐述。在这个比较的过程中，可以看到测序成本，读长和通量是该测序技术先进与否的三个重要指标。其实第一代和第二代测序技术除了通量和成本上的差异之外，测序的核心原理都来自于边合成边测序的思想。第二代测序技术的优点是通量大大提升，成本大大减低，使得昔日王榭堂前燕，可以飞入寻常百姓家。总之，只有变成白菜价，才能真正对大众有意义；但它的缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，同时提高读长，但这个技术还不是很成熟，需要再进化，成本也偏高。
参考文献
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- Mardis, E. R. Next-generation DNA sequencing methods. Annual review of genomics and human genetics 9, 387–402 (2008).
- Shendure, J. & Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nature biotechnology 26, 1135–45 (2008).
- Metzker, M. L. Sequencing technologies - the next generation. Nature reviews. Genetics 11, 31–46 (2010).
- Niedringhaus, T. P., Milanova, D., Kerby, M. B., Snyder, M. P. & Barron, A. E. Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies. 4327–4341 (2011).
- Rothberg, J. M. et al. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature 475, 348–52 (2011).
原文：
http://www.huangshujia.me/2017/08/04/2017-08-04-Begining-WGS-Data-Analysis-Sequecing-Tech.html
https://blog.csdn.net/dyllove98/article/details/9736441
