导读：无缝克隆技术是时下最流行的质粒构建技术，几乎每个分子生物学实验室都在使用。之前我给大家详细讲解了Gibson Assembly的实验设计和操作流程，那么这次给大家介绍另外一种无缝克隆方法——Golden Gate Assembly，希望能对大家的质粒构建实验有所帮助。
说到分子克隆，几乎每个做过质粒构建的小伙伴都知道Gibson Assembly，这个方法实在是太流行了！记得我刚进实验室的时候，师兄师姐教我构建质粒所用的方法就是Gibson Assembly，那个时候整个实验室的人都用Gibson Assembly，我才知道高中生物课和本科生物课上所学的经典的酶切连接方法早就不流行了。后来我看了很多文献，发现除了Gibson Assembly之外，其实还有很多好用的质粒构建方法，与Gibson Assembly几乎同时出现的Golden Gate Assembly就是其中的一种，这两种方法都可用于无缝克隆。
Golden Gate Assembly是一种新型的酶切连接方法 [1, 2]，与传统的酶切连接方法不同。传统的酶切连接方法采用标准的II型限制性内切酶 (限制酶) (例如EcoRI) 切割DNA，这些限制酶通常识别4~8 bp的回文序列，并在识别序列内部切割产生粘性末端或平末端 (图1A)。而Golden Gate Assembly采用IIS型限制酶 (例如BsaI) 切割DNA，这些限制酶识别非回文序列，并在识别序列外部切割产生粘性末端 (图1B)。
【图1】II型限制酶和IIS型限制酶切割DNA
IIS型限制酶切割DNA产生的粘性末端通常为2个碱基或4个碱基。在连接反应中，粘性末端的碱基数越多，连接产物的保真度越高，因此Golden Gate Assembly通常采用能够产生4碱基粘性末端的IIS限制酶，常用的有BsaI、BsmBI和BbsI (图2)。NEB公司对这三种野生型的限制酶进行了分子改造，得到三种识别序列不变但特异性更强的限制酶，分别是BsaI-HFv2、BsmBI-v2和BbsI-HF (图2)。这些限制酶的识别序列长度都是6 bp，因此在DNA序列中出现的概率都是1/4096。
【图2】三种IIS型限制酶的特异性
如图2所示，三种IIS型限制酶的特异性可分别记为：BsaI (GGTCTC 1/5),BsmBI (CGTCTC 1/5),BbsI (GAAGAC 2/6)。除此之外，能够产生3碱基粘性末端的IIS型限制酶SapI (GCTCTTC 1/4) 也常被使用 [3]，这个限制酶虽然产生的粘性末端更短，导致连接产物的保真度会略有降低，但是识别序列长度更长 (为7 bp)，因此在DNA序列中出现的概率是1/16384。根据切割位点序列的不同，BsaI、BsmBI和BbsI可以产生的粘性末端有256种，SapI可以产生的粘性末端有64种。
市面上有许多基于Golden Gate Assembly的克隆试剂盒，不过价格都很贵，我一向建议大家自己买酶和试剂配制反应体系，只要弄懂Golden Gate Assembly的工作原理和实验设计方法就没有问题。下面我以BsaI-HFv2为例，讲讲如何使用Golden Gate Assembly构建质粒。
设计引物
通过PCR引入BsaI的识别序列，识别序列加在引物的5'端，为了确保限制酶能稳定结合到DNA双链上并发挥切割作用，需在识别序列末端加上保护碱基。保护碱基的数量和种类不是固定的，为了简化引物设计，大家可以用TTT作为保护碱基(3 bp的保护碱基对于绝大多数限制酶来说是足够的，若是为了保险起见，也可将保护碱基增加至6 bp。由于切割位点在识别序列的下游且可以是任意序列，因此有3种不同的引物设计方法，如图3所示。
【图3】设计引物的三种策略：N代表任意碱基, 1234和5678代表两个不同的切割位点, N和切割位点既可以利用PCR模板现有的序列，也可以通过引物引入
实验原理
(1) 2个DNA片段的连接
【图4】Golden Gate Assembly连接两个片段
(2) 4个DNA片段的连接
【图5】Golden Gate Assembly连接四个片段：1234, 5678, abcd和efgh代表四个不同的切割位点
上面两个图分别展示了2个片段连接和4个片段连接的工作原理，其他数量片段的连接类似。酶切和连接是在同一个反应体系中进行的，可以用PCR产物作为底物 (如图4和图5)，也可以先将PCR产物分别克隆到质粒载体上，再用质粒作为底物。在合适的实验条件和实验设计下，利用Golden Gate Assembly可以组装超过20个DNA片段。下面这个小视频可以帮助大家进一步理解Golden Gate Assembly的工作原理。
Golden Gate Assembly的工作原理
操作流程
(1) 配制反应体系
① 每个插入片段的加入量可根据载体的加入量与载体和插入片段的长度进行换算，这里提供一个换算工具http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation; ②其他可用的内切酶：BsmBI-v2(NEB #R0739, 10U/µl), BbsI-HF (NEB #3539, 10U/µl), SapI (NEB #R0569,10U/µl); ③若插入片段数量为1~10，则用10 units；若插入片段数量大于10，则用20 units; ④ 若插入片段数量为1~10，则用500 units；若插入片段数量大于10，则用1000units。
(2) 反应程序
注: 37℃是BsaI-HFv2的最适反应温度，若使用其他限制酶，该温度可能需要调整，比如BsmBI-v2的最适温度为42℃。
优点
与传统的酶切连接比较
(1) IIS型限制酶的切割位点在识别序列外部，因此识别序列在酶切过程中被除去，不会在连接产物中引入不必要的序列。
(2) IIS型限制酶对切割位点的序列没有要求，因此可以通过设计切割位点的序列产生不同的粘性末端，使得多片段定向组装成为可能。
(3) 由于识别序列不会残留在连接产物中，因此酶切反应和连接反应可以在同一个反应体系中进行，简化了实验流程。
与Gibson Assembly比较
(1) 片段连接过程中不涉及序列的降解和合成，因此连接产物的保真度更高。
(2) 可以组装的DNA片段数量更多，适用于质粒建库。
(3) 可以组装带有同源序列或重复序列的DNA片段，比如可用于构建表达多个sgRNA的质粒 [4]。
(4) 可以构建标准化的合成生物学元件，这一点类似于和BioBricks。
注意事项
(1) 需选用合适的限制酶，该限制酶的识别序列在最终的连接产物中不能出现。
(2) 设计引物时，识别序列和切割位点的取向要正确。
(3) 当插入片段的数量较多时，为了确保连接的特异性，需要合理设计切割位点的4 bp序列。
参考文献[5] 的Table S7提供了优化的切割位点序列组合
http://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/acssynbio.8b00480/suppl_file/sb8b00480_si_002.xlsxpubs.acs.org
另外，NEB公司提供的Golden Gate Assembly Tool可以帮助大家设计引物
NEB Golden Gategoldengate.neb.com
参考文献：
[1] Engler, C., et al. (2008) PLoS One 3, e3647.
A One Pot, One Step, Precision Cloning Method with High Throughput Capabilitydx.doi.org
[2] Engler, C.,et al.(2009) PLoS One 4, e5553.
[3] Whitman, L., et al. (2013) Genet. Eng. Biotechnol. 33, 42.
(PDF) Rapid, Scarless Cloning of Gene Fragments Using the Electra Vector System.www.researchgate.net
[4] Vad-Nielsen, J., et al. (2016) Cell Mol. Life Sci. 73, 4315–4325.
https://doi.org/10.1007/s00018-016-2271-5doi.org
[5] HamediRad, M., et al. (2019) ACS Synth. Biol. 8, 1047–1054.
Highly Efficient Single-Pot Scarless Golden Gate Assemblydoi.org
