Cell 丨 基因编辑药物的体内递送方法

原创 珍奇 图灵基因 2022-07-12 17:16 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学技术

撰文：珍奇

IF：66.85

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亮点：

本篇综述总结了用于治疗性体内基因编辑的三种基因编辑剂，并概述了体内高效递送载体的基本特征，描述了目前正在进行的临床试验的病毒和非病毒递送方法，最后讨论了病毒样颗粒（VLP）递送系统。作者结合每种策略的优点和缺点，强调了各个方法在未来发展的方向。

体内基因编辑疗法为治疗许多遗传性疾病的根源提供了可能。但想要使治疗性体内基因编辑成为现实，目前的关键在于如何能安全有效地将基因编辑剂输送到体内的相关器官和组织。2022年7月6日，麻省理工学院与哈佛大学的三名研究人员共同在《Cell》杂志上发表了一篇名为“Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents”的综述。在此，他们回顾了目前用于实现治疗性体内基因编辑的递送技术（包括病毒载体、脂质纳米颗粒和病毒样颗粒），比较了每种方法的优点和缺点并强调了未来改进的机会。

治疗性基因编辑策略

图1对三种基因编辑剂进行了简要概述：核酸酶会产生有针对性的双链DNA断裂（DSBs，double-strand DNA breaks），通常会不可控地产生基因插入和基因缺失的混合物。在某些类型的分裂细胞中，DSBs也可以在有DNA供体模板存在的情况下形成同源定向修复（HDR，homology-directed repair）的结果，从而支持基因校正，尽管HDR通常也会伴随着副产物的生成。而碱基编辑器（base editor）可针对碱基对进行转换，起始子编辑器（prime editor）也可实现单核苷酸转换、插入、缺失和组合，这两种方式的副产物相对较少。

图1. 治疗性基因编辑技术概述

体内高效输送工具的基本特征

基因编辑剂可以作为DNA、mRNA，甚至直接作为蛋白质或核糖核酸蛋白（RNPs）被送入细胞。具体来说，有效的体内递送载体必须（1）在进入细胞前包装并保护其货物不被封存或破坏，（2）与所需的细胞结合，（3）穿越目标细胞膜进入细胞内部，以及（4）将其携带物质释放到适当的细胞内隔间。

大多数强大的体内递送工具将其载体封装在蛋白质或脂质外壳中，以保护它们在进入细胞之前不被封存或降解。这种保护使所携带物质在循环中或在给药部位存活，直到载体遇到目标细胞类型。此外，运载工具必须避免被免疫系统识别，因为免疫激活会导致它们成为降解的目标。一些载体成分容易激活补体系统，这可能导致载体被吞噬性免疫细胞清除，而抗体介导的递送载体识别也可能导致吞噬性清除。

在将其载体送入细胞之前，体内运送工具必须首先能够与体内的这些细胞结合。这种进入目标细胞的能力在很大程度上取决于运载工具的给药途径。许多静脉注射的载体可以有效地进入一些组织（如肝脏），但由于内在的生物屏障（如血脑屏障），不能有效地进入其他组织（如中枢神经系统）。将载体局部注射到中枢神经系统（如通过鞘内注射）或眼睛（如通过视网膜下注射）可以绕过生物屏障，使其能够进入某些重要的细胞群。然而，物理接触特定细胞类型的能力并不能保证对该细胞类型的有效传递。递送载体必须能够针对所需的细胞，并且通常使用其表面的部分或特定的靶向分子来吸引目标细胞表面的受体，并促进随后的细胞进入。在成功接触目标细胞后，运载工具必须通过穿越细胞膜进入这些细胞。

在许多情况下，运载工具与细胞表面识别器的结合促进了这些运载工具的内吞作用。留在内体中的载体和货物最终会被降解。因此，成功的运载工具必须逃出内体，在内体外释放其载物，进入细胞膜。许多成功的运载工具利用内体的酸性环境，引发运载工具结构的变化，促进内体逃逸和货物释放。重要的是，高效的运载工具必须足够稳定，以便在细胞外保护其货物，但必须能够在进入细胞和逃离内体后分解和释放其货物。几十年来，研究人员已经发现并发明了几类能够克服这些复杂分子障碍的细胞内递送工具。目前最先进的递送系统，包括病毒载体、LNPs和VLPs，可以满足高效体内递送载体的这些关键标准，因此很适合基因编辑剂的体内递送。

图2. 基因编辑剂高效体内输送的要求

病毒递送系统

病毒在进化过程中自然而然地克服了体内递送的障碍，可以将核酸载体自然地递送到许多细胞类型。由于这些有利的特性，病毒是传递基因编辑剂的重要载体。许多病毒载体已被开发用于体内基因治疗应用，并在超过1000项临床试验中用于传递治疗基因。大多数体内基因编辑应用都利用了腺相关病毒（AAVs），少数临床前研究使用了慢病毒或腺病毒。值得注意的是，一项正在进行的临床试验使用AAVs将基因编辑剂送入眼睛，以治疗一种遗传性失明。图3对病毒递送系统进行了总结和对比。

图3. 病毒传递方法的概述和比较

总的来说，病毒载体在许多临床前研究和一项正在进行的临床试验中显示了在体内传递基因编辑剂的巨大前景。迄今为止，病毒载体提供了一些在许多器官中观察到的最高的基因编辑效率，因为它们具有在体内有效地转导不同类型的细胞并传递其核酸载体的固有能力。未来对病毒载体的改进需要克服挑战包括：载体的免疫原性、基因编辑剂的长期表达、非目标基因编辑、基因组整合的潜力、制造成本和剂量限制的毒性（图3）。提高效力和组织特异性的载体工程方法可以减少所需剂量并降低病毒传递平台的制造成本。在靶向编辑后持久沉默货物表达的方法也将大大改善病毒传递的安全性。正如文中所讨论的，混合病毒和非病毒策略可以通过结合病毒递送的强大效率和非病毒递送方法的瞬时性，提供两个最佳方案。

脂质纳米粒子(LNP)递送系统

脂质纳米颗粒（LNPs）作为在体内传递基因编辑剂的非病毒载体已经越来越受欢迎。几十年来，脂质纳米粒子一直被用来传递核酸载体，包括siRNA和治疗性mRNA。为了将其封装的携带物送入目标细胞，它们首先通过内吞作用进入细胞，在内体酸化后通过破坏内体膜逃离内体，随后进入目标细胞的细胞膜。LNPs是完全合成的，通常由四种成分组成：一种阳离子或可电离的脂质、一种辅助脂质、一种聚乙二醇（PEG）脂质和胆固醇，图4展示了LNP递送系统的结构。LNPs由四个关键成分组成，可以有效地封装各种RNA。封装的 mRNA 通常通过在体外转录过程中加入替代核苷酸进行修饰，例如 N1-甲基假尿苷，以增加递送后的细胞稳定性。包封的向导 RNA 在多个位置进行了化学修饰，包括 2'-O-甲基化和硫代磷酸酯键，从而提高了向导 RNA 的稳定性。

改变这些成分的特性可以产生针对不同的药代动力学特征和不同类型细胞，具有不同特性的LNPs。经过广泛的开发和优化，LNPs已被美国FDA批准用于人体，包括通过静脉注射给肝细胞提供治疗性siRNA和通过肌肉注射给mRNA疫苗。如本文所述LNPs已经被用于临床试验，将Cas9核酸酶mRNA输送到肝脏，并有望成为许多临床体内基因编辑应用的首选输送工具。

图4. 脂质纳米粒子（LNP）递送系统

病毒样颗粒(VLP)递送系统

病毒样颗粒（VLPs）已经成为传递基因编辑剂的潜在工具。VLPs是病毒蛋白的非传染性集合体，它除了包装所需递送的mRNAs、蛋白质或RNPs外，还可以代替病毒基因材料。由于VLPs来自于现有的病毒支架，它们利用了病毒的自然特性，从而实现了高效的细胞内递送，包括它们封装货物的能力，逃避内体的能力，以及重新编程以针对不同类型的细胞。然而，与病毒载体不同，VLPs以mRNA或蛋白质而不是DNA的形式瞬时传递基因编辑剂，这大大降低了脱靶基因编辑和病毒基因组整合的风险。由于这些原因，VLPs是传递基因编辑剂的有吸引力的载体，因为它们可以提供病毒和非病毒传递的关键优势。

图5. 病毒样颗粒（VLP）递送系统

几乎所有报道的用于传递mRNA或蛋白质载体的VLP架构都是基于逆转录病毒，因为逆转录病毒具有几个非常适合VLPs的特性。未成熟的逆转录病毒颗粒是球形的，通常缺乏严格的结构对称性，与大多数非二十面体病毒相比，这使得封装所需载体的灵活性增加。此外，逆转录病毒的大颗粒直径（100-200纳米）为封装大型载体（如Cas9）提供了更多的物理空间。最后，逆转录病毒在细胞定位和货物包装方面具有内在的模块化；细胞类型的特异性由包膜糖蛋白决定，而携带物的包装则由包膜蛋白控制。这种模块化表明，能够有效包装所需货物的VLP包膜结构可以很容易地与现有的各种包膜糖蛋白相结合，这些包膜糖蛋白目前被用于调节逆转录病毒的趋向性。虽然逆转录病毒VLPs作为mRNAs和蛋白质的运载工具已经被探索了几十年，但最近的努力首次实现了VLPs在体内有效运载基因编辑剂的潜力。

教授介绍：

刘如谦 (David R. Liu)，美国华人化学家和生物学家，理查德-梅金教授和梅金医疗转型技术研究所所长，麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所的副主席，哈佛大学自然科学的托马斯-达德利-卡伯特教授，以及霍华德-休斯医学研究所（HHMI）的研究员。他的研究将化学和进化结合起来，以阐明生物学和实现下一代治疗方法。他的主要研究兴趣包括基因组编辑蛋白（如碱基编辑）的工程、进化和体内输送，以研究和治疗遗传疾病；利用噬菌体辅助连续进化（PACE）进化具有新型治疗潜力的蛋白质；利用DNA诱导的有机合成和DNA编码库发现生物活性合成小分子和合成聚合物。他的实验室开创了碱基编辑、质粒编辑、PACE和DNA模板合成四个技术，这些技术被世界各地成千上万的实验室所使用，并使许多遗传疾病的研究和潜在治疗成为可能。

参考文献：

Raguram A, Banskota S, Liu DR. Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents [published online ahead of print, 2022 Jun 28]. Cell. 2022;S0092-8674(22)00395-6. doi:10.1016/j.cell.2022.03.045