目前最流行的蛋白分离定量方法之一就是通过预先在样品中添加稳定同位素标签再使用质谱来对蛋白进行相对定量[1]。标签可以通过混合 C,H,N,O 等的重同位素获得，并可以利用代谢方法或者化学衍生反应到蛋白质上，体内代谢标记方法包括哺乳动物稳定同位素标记技术(stable isotope labeling in mammals, SILAM)和细胞培养条件下稳定同位素标记技术(stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC)[2]等，体外化学衍生方法包括同位素亲和标签(isotope-coded affinity tags, ICAT)[3]，二甲基标记法(dimethyl labeling)[4]，同位素质量标签(isobaric mass tags)[5]等[1]。
除同位素质量标签方法外，其余几种同位素衍生方法都对两种或多种样品的肽段引入了微小的质量差别，从而可以利用一级质谱图(MS1 spectrum)区分它们。通过对比轻标和重标肽段的相对强度，并用统计学方法分析肽段比率而得到蛋白水平差异。而基于同位素标记的定量方法，每个样品都采用不同的同位素质量标签进行标记，之后把样品混合在一起同时进入到质谱中进行检测。由于采用的是同位素标签，不同 TMT 试剂标记的肽段在一级质谱中分子量相同，在同一液相洗脱时间下，一级质谱扫描只在相同的质荷比处出现单一的复合峰，这种设计即可以增强一级质谱信号，还可以有效减少混合样品的复杂性[1]。
由于不同来源但质荷比相同的母离子可被选择进行高能碰撞裂解，在二级碎片中产生两种类型的离子：(a)报告离子峰；(b)肽段的碎片离子峰。报告离子出现在低质量端，可以用来区分不同样品的来源并指示强度，用于相对定量分析。而出现在较高质量短的碎片离子峰则包含有氨基酸序列信息，指示特异性的肽段序列，可以用于肽段鉴定，并最终归集到肽段所存在的蛋白中。由于经胰蛋白酶酶解和同位素标记的多个肽段都可以匹配到同一个蛋白上，也就增加了蛋白定性和定量的可信度[1]。
目前广泛采用的同位素质量标签是基于氨基反应，可以和多数肽段产生反应。标签一般以 NHS 进行改造，结构中包含 3 部分功能基团：氨基反应基团(amine-reactive group)、同位素报告基团(isotopic reporter group)和平衡基团(isotopic
balancer group)。氨基反应基团，可以和肽段 N 端氨基和赖氨酸侧链的ε-氨基发生反应，该基团可以和任意肽段反应，无论蛋白序列如何，也无需考虑所用蛋白酶的特异性，除非是肽段 N 端的氨基酸发生了修饰或者结果变化，比如 N 端谷氨酸的成环反应或者 N 端氨基酸发生乙酰化等。质量平衡基团的加入可以使其与报告基团的总和为常数，一般是通过添加13C，15N 和18O 等稳定同位素。报告基团则给出不同样品中标记肽段的相对强度。本实验中采用的是串联质谱标签(Tandem Mass Tag, TMT)，每个标签包括特定分子量的报告基团，图 2 给出了 TMT 试剂的化学结构和同位素原子位置。
图 1 TMT 试剂的一般化学结构[1]
图 2.2 TMT 6-plex 不同标记试剂中同位素原子的位置[1]
图 2.1 显示了 TMT 试剂的一般化学结构，在二级质谱中，这 3 个基团之间发生断裂，其中蓝色虚线标示了在质谱二级产生报告离子时化学键的断裂位置，平衡基团由于中性丢失不能被检测，图 2.2 则显示了TMT 6-plex不同标记试剂中同位素原子的位置，通过在报告基团和平衡基团中加入 5 个13C 和15N 的重标同位素，获得 126,127,128,129,130,131 等 6 种不同标记试剂[1]。目前该技术已在很多对比分析实验中得到了验证，本实验中大致流程如图3：
图 3 TMT 蛋白定量技术、联合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的技术路线[1]
而 TMT 与 iTRAQ 技术相类似，主要有以下几种优点[1]：
（1）该方法对所有类型的蛋白质样品；
（2）通过氨基标记反应，标记率高，可以用于相对定量，且定量结果重复性高；
（3）样品通量高，目前 TMT 标记最多可以用于 10 组样本同时相对定量，即加快了检测速度，也使得实验过程中的技术误差显著降低。
参考文献
[1] 基于TMT技术的关于弥漫性特发性骨肥厚症的血清蛋白质组学研究, 韩岳, 天 津医科大学研究生院.2016.
[2] Ong SE, BlagoevB, Kratchmarova I, et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as asimple and accurate approach to expression proteomics. Mol. Cell. Proteomics,2002, 1: 376−386.
[3] Gygi S P, Rist
B, Gerber SA, et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using
isotope-coded affinity tags. Nat. Biotechnol, 1999, 17: 994−999.
[4] Hsu JL, Huang
SY, Chow NH, et al. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative
proteomics. Anal. Chem, 2003, 75: 6843−6852.
[5] Ross PL, Huang
YN, Marchese JN, et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces
cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell.
Proteomics, 2004, 3: 1154−1169.
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