GRO-seq 分析
第一篇就以最近做过的GRO-seq分析为例来展开吧。
GRO-seq的原理和用处
GRO-seq 全称 Global run-on sequencing, 是一种新生转录本RNA的测序方法（Core et al., 2008）。它能够map基因组上RNA polymerase正在转录的位置，并且定量。在RNA 合成时，掺入NTP类似物bromouridine（BrU）, 新合成的RNA 便带上了BrU，BrU可以通过抗体被capture下来。RNA反转录成cDNA后，可以被建库测序，从而得知RNA合成的位置和定量。这样能够准确地反映出某一时刻RNA polymerase的位置和活动。可不要小看这个方法，通过这个方法，发现了在人类基因中，RNA polymerase 停在promoter附近的现象；还发现了RNA polymerase 在终止转录时，会越过基因的3‘end下游（pre-mRNA 3' end cleavage site）。另外，也发现enhancer也可以产生短的不稳定RNA。关于这些发现，推荐阅读Core et al., 2008.
而对于RNA-seq来说，通过poly-A 等方法捕获所得到的是成熟的mRNA，一方面，无法观察到这些现象，另一方面所测到的成熟mRNA是细胞mRNA的累积量，而无法反应某一时刻基因是否正在转录。
距离GRO-seq开发出来，已经过去了10余年。期间，测nascent transcription 的方法也在进步和发展，例如和利用抗体富集的NET-seq（native elongating transcript sequencing）（Nojima et al., 2015）和利用biotin-labeled NTP 的PRO-seq（Mahat et al., 2016）可以实现单碱基分辨率的新生RNA鉴定; 可以精确鉴定TSS处RNA polymerase pausing site的PRO-Cap，ChRO-seq（Chu et al., 2018）。关于这些方法的详细介绍和比较先留个坑，以后再填。今天我们主要想介绍一下GRO-seq的分析流程。
GRO-seq分析流程
同一般的高通量测序分析，GRO-seq的分析也主要分三步，首先进行pre-processs reads，即去掉adaptor等序列；随后进行序列比对，最后分析比对结果。我们以mouse activated primary B cell 的GRO-seq (GEO: GSE116321,GSM3227964)为例进行演示。一般来讲，GRO-seq的建库方法是单端测序的，读长较短为75bp。
预处理和序列比对
首先下载数据。使用ascp高速下载：
ascp -i ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh -Tr -Q \
anonftp@ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov:/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR744/SRR7440347/SRR7440347.sra .
fastq-dump --split-3 --gzip SRR7440347.sra
然后进行cutadapt trim adaptor
cutadapt -a GATCGGAAGAGCACACGTCT -a ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC -o SRR7440347.trimmed.fastq SRR7440347.fastq
使用bwa比对reads
filename=nsRNA_preB_GSM3227964
bwa aln -t 20 /home/hulab/chen/databases/bwa_indexes/mm10 SRR7440347.trimmed.fastq > ./SRR7440347.sai
bwa samse -n 1 /home/workdir/chen/databases/bwa_indexes/mm10 SRR7440347.sai SRR7440347.trimmed.fastq | samtools view -bS -q 30 - | samtools sort - > ${filename}.bam
samtools index ${filename}.bam
去除rRNA reads
这时，我们所得到的reads就是新生RNA链产生的了。但是注意哦，这里的reads不仅仅包括来自一般基因的RNA polymerase II 转录的，还包括了RNA polymerase I 转录的核糖体RNA，核糖体RNA转录的一般不是我们想要看的基因。需要对核糖体RNA进行去除。
小鼠的核糖体rRNA可以从UCSC上获得。
由于实验中已经进行了去除rRNA的步骤，因此去除rRNA 在总量上影响不大。
bed_rRNA=/home/workdir/chen/databases/mouse/genes_annotation/mm10_rRNA.bed
bedtools intersect -v -a ${filename}".bam" -b $bed_rRNA > ${filename}"_rm_rRNA.bam"
samtools view ${filename}"_rm_rRNA.bam" > ${filename}"_rm_rRNA.sam"
下游分析
下游的分析包括几类。
针对于基因来讲：新转录本的鉴定、基因的定量分析、promoter pausing index 的计算
和enhancer的分析，这里不展开了.
使用homer做这些分析非常方便：
homer
首先先建立一个directory，利用makeUCSCfile 将bam转换成bedGraph 格式，可以直接放在IGV里面可视化。
dir=$filename
###
makeTagDirectory $dir ${filename}"_rm_rRNA.sam" \
-genome mm10 -format sam -checkGC
# Estimated average read density = 0.004548 per bp
makeUCSCfile $dir/ -strand both -norm 1e6 -o ${filename}.bdg
然后对gene body 和TSS附近的reads 分别进行定量分析。
#-------------- quantification of RNA and identify active genes ---------#
# the total reads are only 12 millions, so norm to 1e6
# the strand of gene is opposite to the reference.
analyzeRepeats.pl rna mm10 -count genes -condenseGenes -norm 1e6 -d $dir > ${filename}_genes_norm.txt
analyzeRepeats.pl rna mm10 -count pausing -condenseGenes -norm 1e6 -d $dir > ${filename}_pausing_norm.txt
结果分析
gene body 上的定量。 最后一列是normalize的 gene的RPM。
promoter 附近的定量。
这里定义的promoter 指 TSS 附近（-50，200）， 而gene body 所取的region是 （200，5000）。所谓Pausing ratio = TSS处的reads数/ gene body reads, 见倒数三列。这样就知道了每个基因的附近 RNA polymerase的pausing 情况了。由于是比值，如果TSS read 和 gene body reads 都是0， 那么这个比值是1 ，这样的情况应该不被考虑。注意去除。
参考文献
Core, L.J., Waterfall, J.J., and Lis, J.T. (2008). Nascent RNA Sequencing Reveals Widespread Pausing and Divergent Initiation at Human Promoters. Science 322, 1845–1848.
Nojima, T., Gomes, T., Grosso, A.R.F., Kimura, H., Dye, M.J., Dhir, S., Carmo-Fonseca, M., and Proudfoot, N.J. (2015). Mammalian NET-Seq Reveals Genome-wide Nascent Transcription Coupled to RNA Processing. Cell 161, 526–540.
Mahat, D.B., Kwak, H., Booth, G.T., Jonkers, I.H., Danko, C.G., Patel, R.K., Waters, C.T., Munson, K., Core, L.J., and Lis, J.T. (2016). Base-pair-resolution genome-wide mapping of active RNA polymerases using precision nuclear run-on (PRO-seq). Nature Protocols 11, 1455–1476.
Chu, T., Rice, E.J., Booth, G.T., Salamanca, H.H., Wang, Z., Core, L.J., Longo, S.L., Corona, R.J., Chin, L.S., Lis, J.T., et al. (2018). Chromatin run-on and sequencing maps the transcriptional regulatory landscape of glioblastoma multiforme. Nat Genet 50, 1553–1564.
pipeline from Danko Lab
https://github.com/Danko-Lab/tutorials/blob/master/PRO-seq.md
小tip：
GRO-seq使用BrU，研究的是以DNA为模板的转录情况。而加polyA 是在mRNA上直接加的，并且不会利用BrU。因此GRO-seq分析不用去除polydA 尾巴。
GRO-seq为什么使用短的读长：为了研究RNA polymerase 的移动，降低了NTP的浓度，使得polymerase走的比较慢。最长走80-100bp。
链特异性：是要在单链的时候就加上adaptor才能知道。如果是双链加上adaptor则无法知道。
