抗体的结构
二抗的结合
1. 一抗选择指南
一抗是能和非抗体性抗原（特异性抗原）特异性结合的蛋白。种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。一抗可以特异性地结合底物，识别出我们想要检测的东西。检测任何靶蛋白都有多种抗体可供选择，那如何进行一抗的选择呢？
1）确定实验样本的种属
确定自己实验所用样本的种属，如human、rat、mouse、pig、goat等。应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高。如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过。可以通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy和NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。如果比对结果，证明同源性比较高的，也可以选择。
（2）确定实验类型
确定自己的实验类型，如WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等，一般抗体说明书会列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如未提及并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证。如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。
（3）分析样本蛋白的结构性质
分析了解样本蛋白的结构性质有助于选择合适的抗体，抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FCM流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。
（4）抗体宿主物种的选择
一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应，例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，而是选兔源的一抗，二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大。
2. 二抗选择指南
二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如ELISA（以偶联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）,免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）等。
二抗针对某一特定物种（如小鼠）的抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号增强，提高了实验灵敏度。二抗可以偶联有几种不同的标记，可以是酶，荧光素，或生物素。如何选择二抗？通常情况下，某一特定的实验中可能同时有几种二抗可供选择，如何能选择到适合该实验的二抗，需要综合以下几个方面进行考虑：
（1）一抗的种属来源
根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。如果一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
（2）一抗是属于哪个类或亚类
除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需与一抗的类别或亚类相匹配，这通常是针对单克隆抗体而言。一般来说多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。而单克隆抗体则相对复杂些，由于单克隆抗体有不同的类别和亚型，因此相应的二抗也需要根据这些亚型进行选择。
（3）二抗的种属来源
一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，此时二抗就不能选山羊或者小鼠来源的。选择相应的驴来源的二抗，就非常适合做类似双标的免疫实验。双标得2个都抗才行，故选择第3个种源的抗体。
（4）选择哪种形式的二抗，是整个IgG分子，Fab片段，还是F(ab')2片段？
整个IgG分子：此种抗体适用于多数情况。
Fab片段：它们只有一个结合位点，一般用来封闭内源性免疫球蛋白。
F(ab')2片段：该种抗体是由两个靠二硫键连接的用于结合抗原的Fab片段组成，这些抗体用在特定的情况中，如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况。
（5）二抗的偶联标记
一般来讲，偶联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于western blot和ELISA，常用的二抗是酶标二抗，而细胞或组织标记实验（组织免疫化学，细胞免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。
（6）抗体的纯度
亲和层析纯化的抗体一般更受欢迎，因为这些产品的纯度更高，产生的非特异性背景也少。但是有些情况下也要考虑到纯化过程中损失的IgG部分，因为其中含有亲和力高的抗体，尤其是当目的抗原存在的量较小的时候。
Protein A与Protein G有何不同？
目前，绝大多数的IgG纯化使用Protein A、Protein G亲和层析，它们是来自于不同微生物的蛋白质，对于IgG具有特异性的亲和作用，而对于其他杂蛋白没有或者只有很弱的结合，因此具有极高的选择性。通常，仅凭Protein A、Protein G一步亲和层析就可达到90%的纯度。但是Protein A、Protein G又有什么不同呢？该如何选择呢？
1.Protein A
Protein A是金黄色葡萄球菌表面的蛋白，分子量42kDa，有5个不同的结构域可以结合IgG的Fc片段，具有很强的特异性亲和力，每个Protein A分子至少可以结合两个IgG分子。同时，IgA、IgM或者IgE也有可能和Protein A结合。
nProtein A：天然Protein A，无动物来源组分，载量约30mg人IgG/ml。
rProtein A：重组Protein A ，C-端新增一个Cysteine，可以单一位点定向偶联于琼脂糖基架上，降低与抗体接触的空间位阻，提高了载量，约50mg人IgG/ml。雅心重组蛋白A为本公司自主研发产品，非抗体柱纯化，产品中无任何其它抗体如IgG等的污染；pH耐受范围广，可耐受0.5 M NaOH和0.5M HCl 处理，不降解，抗体结合能力不变。
2. Protein G
Protein G并不是我们熟知的G Protein（细胞表面G蛋白）， 而是G族链球菌的细胞表面蛋白，分子量25kDa，和IgG的Fc区域特异性结合，还能以低亲力与Fab区域特异性的结合，但不与IgA和IgM结合。相比于Protein A，Protein G可以更广泛、更强地、与更多类型的IgG结合，但是载量却较低，约20mg人IgG/ml。
Protein A和Protein G的多个结构域可与IgG结合
Protein A 和 Protein G对于不同物种和亚型的IgG的亲和力如下表；
Protein A与Protein G有何不同？如何选择？ - 知乎 (zhihu.com)
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