Minimap2 用户手册

概述

• 名称
  • minimap2 - DNA序列集合之间的映射和比对

内容

• 简介
• 描述
• 选项
  • 索引选项
  • 映射选项
  • 对齐选项
  • 输入/输出选项
  • 预设选项
  • 其他选项
• 输出格式
• 限制
• 参考

简介

Minimap2是一个快速的序列映射和比对程序，能够找到长噪声读段之间的重叠，或者将长读段或它们的组装映射到参考基因组上，并且可以选择性地进行详细比对（即CIGAR）。目前，它能够高效地处理从几千碱基到约100兆碱基长度的查询序列，错误率约为15%。Minimap2以PAF或SAM格式输出。

选项

索引选项

• k INT: 最小化k-mer长度 [15]
• w INT: 最小化窗口大小 [k-mer长度的2/3]。最小化是w个连续k-mer窗口中的最小k-mer。
• H: 使用同聚物压缩（HPC）最小化。HPC序列是通过将同聚物运行压缩为单个碱基来构建的。HPC最小化是HPC序列上的最小化。
• I NUM: 索引时最多加载NUM个目标碱基到RAM [4G]。
• --idx-no-seq: 不在索引中存储目标序列。节省磁盘空间和内存，但这样生成的索引将不适用于-a或-c选项。

映射选项

• U INT1[,INT2]: k-mer出现的下限和上限 [10,1000000]。
• e INT: 每隔INT碱基对采样一个高频最小化 [500]。
• g NUM: 如果在NUM-bp内没有最小化，则停止链的延伸 [10k]。
• r NUM1[,NUM2]: 链化和基础对齐的带宽 [500,20k]。

对齐选项

• A INT: 匹配得分 [2]。
• B INT: 不匹配的惩罚 [4]。
• O INT1[,INT2]: 间隙开放惩罚 [4,24]。

输入/输出选项

• a: 生成CIGAR并在SAM格式中输出比对。Minimap2默认以PAF输出。
• o FILE: 将比对输出到FILE [stdout]。
• Q: 在输入文件中忽略碱基质量。

预设选项

• x STR: 预设 []。这个选项同时应用多个选项。它应该在其他选项之前应用，因为后面应用的选项将覆盖-x设置的值。

输出格式

Minimap2默认以成对映射格式（PAF）输出映射位置。PAF是一个制表符分隔的文本格式，每行至少包含12个字段。

限制

Minimap2在通过长低复杂性区域时可能产生次优比对，因为在这些区域种子位置可能是次优的。

Minimap2需要SSE2或NEON指令来编译。可以添加非SSE2/NEON支持，但这会使Minimap2的速度慢几倍。
以下是GitHub上lh3/minimap2页面的中文翻译，按照Markdown格式整理：

# 开始使用

## 获取Minimap2
```bash
git clone https://github.com/lh3/minimap2
cd minimap2 && make

长序列与参考基因组比对

./minimap2 -a test/MT-human.fa test/MT-orang.fa > test.sam

先创建索引再映射

./minimap2 -x map-ont -d MT-human-ont.mmi test/MT-human.fa
./minimap2 -a MT-human-ont.mmi test/MT-orang.fa > test.sam

使用预设（无测试数据）

./minimap2 -ax map-pb ref.fa pacbio.fq.gz > aln.sam       # PacBio CLR基因组读取
./minimap2 -ax map-ont ref.fa ont.fq.gz > aln.sam         # Oxford Nanopore基因组读取
./minimap2 -ax map-hifi ref.fa pacbio-ccs.fq.gz > aln.sam # PacBio HiFi/CCS基因组读取 (v2.19或更高版本)
./minimap2 -ax lr:hq ref.fa ont-Q20.fq.gz > aln.sam       # Nanopore Q20基因组读取 (v2.27或更高版本)
./minimap2 -ax sr ref.fa read1.fa read2.fa > aln.sam      # 短的基因组成对末端读取
./minimap2 -ax splice ref.fa rna-reads.fa > aln.sam       # 剪接长的读取（链不明确）
./minimap2 -ax splice -uf -k14 ref.fa reads.fa > aln.sam  # 噪声的Nanopore直接RNA-seq
./minimap2 -ax splice:hq -uf ref.fa query.fa > aln.sam    # 最终PacBio Iso-seq或传统的cDNA
./minimap2 -ax splice --junc-bed anno.bed12 ref.fa query.fa > aln.sam  # 优先考虑注释的连接点
./minimap2 -cx asm5 asm1.fa asm2.fa > aln.paf             # 种内asm-to-asm比对
./minimap2 -x ava-pb reads.fa reads.fa > overlaps.paf     # PacBio读取重叠
./minimap2 -x ava-ont reads.fa reads.fa > overlaps.paf    # Nanopore读取重叠

详细命令行选项

man ./minimap2.1

目录

• 开始使用
• 用户指南
  • 安装
  • 一般用法
  • 使用案例
    • 映射长噪声基因组读取
    • 映射长mRNA/cDNA读取
    • 寻找长读取之间的重叠
    • 映射短准确基因组读取
    • 全基因组/组装比对
  • 高级特性
    • 处理>65535个CIGAR操作
    • 可选的cs标签
    • 使用PAF格式
  • 算法概览
  • 获取帮助
  • 引用minimap2
• 开发者指南
• 限制

用户指南

Minimap2是一个多功能序列比对程序，可将DNA或mRNA序列与大型参考数据库比对。典型用例包括：(1)将PacBio或Oxford Nanopore基因组读取映射到人类基因组；(2)寻找错误率约为15%的长读取之间的重叠；(3)针对参考基因组的PacBio Iso-Seq或Nanopore cDNA或直接RNA读取进行剪接感知比对；(4)比对Illumina单端或成对末端读取；(5)组装到组装比对；(6)两个密切相关物种之间的全基因组比对，差异度低于15%。

对于约10kb的噪声读取序列，minimap2的速度是BLASR、BWA-MEM、NGMLR和GMAP等主流长读取映射器的数十倍。在模拟长读取上更准确，产生的比对具有生物学意义，可为下游分析做好准备。对于大于100bp的Illumina短读取，minimap2的速度是BWA-MEM和Bowtie2的三倍，在模拟数据上同样准确。详细的评估可从minimap2论文或预印本获得。

安装

Minimap2针对x86-64 CPU进行了优化。你可以从发布页面获取预编译的二进制文件：

curl -L https://github.com/lh3/minimap2/releases/download/v2.28/minimap2-2.28_x64-linux.tar.bz2 | tar -jxvf -
./minimap2-2.28_x64-linux/minimap2

如果你想从源代码编译，你需要安装C编译器、GNU make和zlib开发文件。然后在源代码目录中输入make进行编译。如果出现编译错误，尝试make sse2only=1禁用SSE4代码，这将使minimap2速度略慢。

Minimap2也适用于支持NEON指令集的ARM CPU。要为32位ARM架构（如ARMv7）编译，使用make arm_neon=1。要为64位ARM架构（如ARMv8）编译，使用make arm_neon=1 aarch64=1。

Minimap2可以使用SIMD Everywhere (SIMDe)库将实现移植到不同的SIMD指令集。要使用SIMDe编译，使用make -f Makefile.simde。要为ARM CPU编译，请使用上面给出的与ARM相关的命令行和Makefile.simde。

一般用法

不加任何选项时，minimap2以参考数据库和查询序列文件为输入，生成近似映射（即坐标仅是近似值，输出中没有CIGAR），以PAF格式呈现：

minimap2 ref.fa query.fq > approx-mapping.paf

你可以要求minimap2在PAF的cg标签生成CIGAR：

minimap2 -c ref.fa query.fq > alignment.paf

或以SAM格式输出比对：

minimap2 -a ref.fa query.fq > alignment.sam

Minimap2可以无缝处理gzip压缩的FASTA和FASTQ格式输入。你不需要先将FASTA和FASTQ之间转换或解压缩gzip文件。

对于人类参考基因组，minimap2在映射前需要几分钟生成参考的最小化索引。为了减少索引时间，你可以使用选项-d保存索引，并在minimap2命令行上用索引文件替换参考序列文件：

minimap2 -d ref.mmi ref.fa                     # 索引
minimap2 -a ref.mmi reads.fq > alignment.sam   # 比对

重要的是，需要注意的是，一旦你构建了索引，如-k、-w、-H和-I这样的索引参数在映射期间不能更改。如果你为不同类型的数据运行minimap2，你可能需要保留多个用不同参数生成的索引。这使得minimap2与BWA不同，BWA不管查询数据类型如何总是使用相同的索引。

使用案例

Minimap2对所有应用使用相同的基础算法。然而，由于它支持不同类型的数据（例如，短与长读取；DNA与mRNA读取），minimap2需要调整以获得最佳性能和准确性。通常建议使用选项-x选择一个预设，该选项同时设置多个参数。默认设置与map-ont相同。

映射长噪声基因组读取

minimap2 -ax map-pb  ref.fa pacbio-reads.fq > aln.sam   # PacBio CLR读取
minimap2 -ax map-ont ref.fa ont-reads.fq > aln.sam      # Oxford Nanopore读取
minimap2 -ax map-iclr ref.fa iclr-reads.fq > aln.sam    # Illumina Complete Long Reads

map-pb和map-ont的区别在于map-pb使用同聚物压缩（HPC）最小化为种子，而map-ont使用普通最小化为种子。经验评估表明，HPC最小化在对齐PacBio CLR读取时提高了性能和灵敏度，但在对齐Nanopore读取时却有所损害。map-iclr使用调整后的对齐计分矩阵，考虑到读取中整体错误率较低，其中转换错误比颠换错误少。

映射长mRNA/cDNA读取

minimap2 -ax splice:hq -uf ref.fa iso-seq.fq > aln.sam       # PacBio Iso-seq/传统cDNA
minimap2 -ax splice ref.fa nanopore-cdna.fa > aln.sam        # Nanopore 2D cDNA-seq
minimap2 -ax splice -uf -k14 ref.fa direct-rna.fq > aln.sam  # Nanopore直接RNA-seq

minimap2 -ax splice --splice-flank=no SIRV.fa SIRV-seq.fa    # 针对SIRV对照的映射

有不同种类的长读取RNA-seq技术，包括传统的全长cDNA、EST、PacBio Iso-seq、Nanopore 2D cDNA-seq和直接RNA-seq。它们产生的数据质量和属性各不相同。默认情况下，-x splice假定读取相对于转录本链的方向未知。它尝试两轮比对以推断方向，如果可能的话，将链写入ts SAM/PAF标签。对于Iso-seq、直接RNA-seq和传统全长cDNA，应用-u f强制minimap2只考虑正向转录本链是可取的。这加快了比对速度，并略微提高了准确性。对于噪声的Nanopore直接RNA-seq读取，建议使用较小的k-mer大小，以增加对首尾外显子的灵敏度。

Minimap2根据最大得分子段的得分对齐比对，不包括内含子，并在SAM中将最佳比对标记为主比对。当一个剪接基因也有未剪接的假基因时，minimap2不会有意地偏好剪接比对，尽管在实践中它更经常将剪接比对标记为主比对。默认情况下，minimap2输出多达五个次要比对（即在RNA-seq映射的背景下可能是假基因）。这可以通过选项-N进行调整。

对于长的RNA-seq读取，minimap2可能会产生由基因融合/结构变异引起的嵌合比对，或者由于内含子长度超过最大内含子长度-G（默认为200k）而引起的嵌合比对。目前，不建议应用过大的-G，因为这会减慢minimap2的速度，有时会导致错误的比对。

值得注意的是，默认情况下-x splice更倾向于GT[A/G]..[C/T]AG而不是GT[C/T]..[A/G]AG，然后是其他剪接信号。考虑一个额外的碱基可以提高噪声读取的连接点准确性，但在对齐广泛使用的SIRV对照数据时会降低准确性。这是因为SIRV不遵循进化保守的剪接信号。如果你正在研究SIRV，你可以应用--splice-flank=no让minimap2只模拟GT..AG，忽略额外的碱基。

自v2.17以来，minimap2可以可选地接受注释基因作为输入，并优先考虑注释的剪接连接点。要使用此功能，你可以：

paftools.js gff2bed anno.gff > anno.bed
minimap2 -ax splice --junc-bed anno.bed ref.fa query.fa > aln.sam

这里，anno.gff是GTF或GFF3格式的基因注释（gff2bed自动测试格式）。gff2bed的输出是12列的BED格式，或BED12格式。使用--junc-bed选项时，如果对齐的连接点与注释中的连接点匹配，minimap2会增加一个奖励得分（由--junc-bonus调整）。选项--junc-bed也接受5列BED，包括链场。在这种情况下，每一行表示一个定向连接点。

寻找长读取之间的重叠

minimap2 -x ava-pb  reads.fq reads.fq > ovlp.paf    # PacBio CLR读取重叠
minimap2 -x ava-ont reads.fq reads.fq > ovlp.paf    # Oxford Nanopore读取重叠

同样，ava-pb使用HPC最小化，而ava-ont使用普通最小化。通常不建议在重叠模式中执行基础比对，因为它很慢，可能会产生假阳性重叠。然而，如果性能不是问题，你可以尝试添加-a或-c。

映射短准确基因组读取

minimap2 -ax sr ref.fa reads-se.fq > aln.sam           # 单端比对
minimap2 -ax sr ref.fa read1.fq read2.fq > aln.sam     # 配对末端比对
minimap2 -ax sr ref.fa reads-interleaved.fq > aln.sam  # 配对末端比对

当指定两个读取文件时，minimap2依次从每个文件中读取，并将它们合并为内部的交错流。如果两个读取在输入流中相邻并且具有相同的名称（如果存在/[0-9]后缀，则会进行修剪），则认为它们是配对的。可以混合单端和配对末端读取。

Minimap2对短剪接读取的处理效果不佳。对于短读取，有许多能够处理RNA-seq的映射器。

全基因组/组装比对

minimap2 -ax asm5 ref.fa asm.fa > aln.sam       # 组装到组装/参考比对

对于跨物种全基因组比对，需要根据序列差异调整计分系统。

高级特性

处理>65535个CIGAR操作

由于设计缺陷，BAM不适用于具有>65535个操作的CIGAR字符串（SAM和CRAM可以）。然而，对于超长纳米孔读取，minimap2可能会比BAM的能力对齐约1%的读取碱基，其CIGAR很长。如果你将这样的SAM/CRAM转换为BAM，Picard和最近的samtools会抛出错误并中止。旧版本的samtools和其他工具可能会创建损坏的BAM。

为了避免这个问题，你可以在minimap2命令行添加选项-L。此选项将长CIGAR移动到CG标签，并将完全剪辑的CIGAR留在SAM CIGAR列。当前不读取CIGAR的工具（例如合并和排序）仍然可以处理这样的BAM记录；读取CIGAR的工具将有效忽略这些记录。已决定未来的工具将无缝识别由选项-L生成的长CIGAR记录。

TL;DR：如果你使用超长读取并且使用仅处理BAM文件的工具，请添加选项-L。

可选的cs标签

cs SAM/PAF标签对不匹配和INDEL处的碱基进行编码。它匹配正则表达式/(:[0-9]+|\*[a-z][a-z]|[=\+\-][A-Za-z]+)+/。像CIGAR一样，cs由一系列操作组成。每个前导字符指定操作；后面的序列是参与操作的序列。

cs标签由命令行选项--cs启用。例如，以下比对：

CGATCGATAAATAGAGTAG---GAATAGCA
||||||   ||||||||||   |||| |||
CGATCG---AATAGAGTAGGTCGAATtGCA

表示为:6-ata:10+gtc:4*at:3，其中:[0-9]+表示相同区块，-ata表示删除，+gtc表示插入，*at表示参考碱基a被查询碱基t替换。它类似于MD SAM标签，但是独立的，更容易解析。

如果使用--cs=long，cs字符串还将包含比对中的相同序列。上述示例将变为=CGATCG-ata=AATAGAGTAG+gtc=GAAT*at=GCA。cs的长格式在一条字符串中编码了参考和查询序列。cs标签还编码内含子位置和剪接信号（详见minimap2手册页）。

使用PAF格式

Minimap2还附带了一个（java）script paftools.js，用于处理PAF格式的比对。它从组装到参考的比对中调用变体，基于比对提升BED文件，转换格式，并提供各种评估的实用工具。详情请参阅misc/README.md。

算法概览

在以下内容中，minimap2命令行选项前面有一个短划线，并且用粗体突出显示。描述可能有助于调整minimap2参数。

1. 读取-I [= 4G] 参考碱基，提取(-k, -w)-最小化并将其索引在哈希表中。
2. 读取-K [= 200M] 查询碱基。对于每个查询序列，执行步骤3到7：
3. 对于查询上的每个(-k, -w)-最小化，检查对参考索引。如果一个参考最小化不是在顶部-f [= 2e-4] 最频繁的，收集它在参考中的出现，称为种子。
4. 按参考中的位置对种子进行排序。使用动态规划将它们串联。每个串联表示一个潜在的映射。对于读取重叠，报告所有串联然后转到步骤8。对于参考映射，执行步骤5到7：
5. 让P是主映射集合，最初是一个空集。对于每个串联，根据它们的串联得分从最好到最差：如果在查询上，该串联与P中的串联重叠
   --mask-level [= 0.5] 或更高比例的较短串联，将该串联标记为P中的串联的次要；否则，将该串联添加到P。
6. 保留所有主映射。还要保留多达-N [= 5] 个顶级次要映射，如果它们的串联得分高于它们对应的主映射的-p [= 0.8]。
7. 如果请求了比对，过滤出可能导致既长插入又长删除的内部种子。从最左边的种子扩展。在内部种子之间执行全局比对。如果全局比对沿累积得分下降-z [= 400]，则拆分串联，不考虑长间隔。从最右边的种子扩展。输出串联及其比对。
8. 如果输入中还有更多查询序列，转到步骤2，直到没有更多查询为止。
9. 如果还有更多参考序列，从一开始就重新打开查询文件，然后转到步骤1；否则停止。

开发者指南

Minimap2不仅是一个命令行工具，还是一个程序库。它提供了C API来构建/加载索引和对比对索引的序列。文件example.c演示了C API的典型用法。头文件minimap.h提供了更详细的API文档。Minimap2的目标是保持此头文件中的API稳定。文件mmpriv.h包含额外的私有API，可能会频繁更改。

此存储库还提供了对C API子集的Python绑定。文件python/README.rst提供了完整的文档；python/minimap2.py显示了一个例子。这个Python扩展，mappy，也可以通过PyPI pip install mappy或通过BioConda conda install -c bioconda mappy获得。

限制

• minimap2可能会在长低复杂性区域产生次优比对，其中种子位置可能是次优的。这不应是一个大问题，因为即使最优比对在这些区域也可能是错误的。
• minimap2需要在x86 CPU上的SSE2指令或ARM CPU上的NEON。可以添加非SIMD支持，但这将使minimap2慢几倍。
• minimap2不适用于单个查询或数据库序列约20亿碱基或更长（确切地说是2,147,483,647）。所有序列的总长度可以远远超过这个阈值。
• minimap2经常错过小外显子。