样本前处理
上面的图描述了整个蛋白质组学的分析流程：咱们先从组织、体液或细胞中提取蛋白质，拿到蛋白混合溶液（根据你的研究目的，可以对蛋白先做分离，或者不分离），接下来还原烷基化（还原的过程是将蛋白的二硫键打开，然后烷基化可以修饰巯基，防止游离的巯基再生成二硫键）处理，并酶解成肽段。红线以上都属于样品的制备阶段。
既然蛋白质谱实验的目的，是为了尽可能准确地对尽可能多的蛋白进行检测，那么，顺理成章的，我们做这些复杂的前处理的目的，就是要减少在实验阶段对蛋白的人为降解和修饰，释放尽可能多的肽段，送进质谱来检测。
为了更好地聊这个问题，我们先来复习一下如何利用质谱检测蛋白质，以此来反推前期样品处理需要达到怎样的目的。
拿到处理好的蛋白样品以后，我们先将样品酶解成肽段，得到一级谱图，再由肽段离子与惰性气体碰撞生成碎片离子，得到二级谱图。然后我们用实验谱图与理论谱图进行匹配，从而判断肽段的氨基酸组成，然后再根据肽段反推出蛋白质。
上图的最下面是是数据库里搜索的序列，绿色部分是置信度在95%以上的肽段，红色是置信度在50%以上的肽段。基于这些置信度比较高的肽段，我们才能推断出这个蛋白存在于样品中。所以，对于每个蛋白质来说，根据实验谱图匹配到的肽段越多，对于这个蛋白的鉴定结果就越可信。
那么，样品预处理时，首要目的就是避免随机降解，才能得到用特定蛋白酶特异性剪切得到的肽段，拿这些肽段生成的实验谱图与理论谱图比对，才能得到可靠的比对结果。否则，蛋白的随机断裂位点与特异性酶切位点根本对不上，那拿到的实验谱图与理论谱图完全就是两回事，最后的结果就是，要么检测不到蛋白，要么检测到的都是错的。
样本的收集与保存
样本预处理之前，我们需要先收集和保存样品。这一步可不能马虎，如果收集的方法或者保存的方式不得当，就会严重影响后面的预处理步骤以及实验结果！以下三类样品的收集与保存尤其需要留意：
组织样品
1） 对于人体手术切除的组织，有条件的话，最好用PBS（磷酸缓冲盐溶液，作为溶剂，起溶解保护试剂的作用）取完之后直接去血。如果没有去血，可以-80℃液氮保存，干冰运输。
2）对于小鼠、大鼠、兔子之类的组织样品，建议用灌流的方式来去血，尤其是像肝脏、胃、心脏这类大的组织，可以直接用灌流的方式去血，去得最干净。其次的方案是在后期剪碎的时候去血。
话说，这里为什么要强调去血呢？因为血液中有十几种含量特别高的高丰度蛋白质，占了血液蛋白总量的95%，如果你的研究目标并不包括血液蛋白，而这部分蛋白又存在于样品中，那就悲剧了。大家回忆一下，我们第一节课的听课笔记中专门提到的数据依赖性采集（DDA），当样品中有大量高丰度蛋白的时候，来自中低丰度蛋白的肽段信号就会被大大抑制，连进入二级质谱的机会都会变得很渺茫，还怎么愉快地检测？
细胞样品
常规实验，建议收到5*1E6-1E7个细胞以上的样品量（有些实验需要的样品量会少一些，后面会详细讲）。细胞取好后，首先用PBS清洗一下细胞表面，因为大部分培养基里面都含有血清，这部分血清得洗干净了先~
如果是做分泌蛋白研究的话，首先用PBS清洗样品几次，再用条件培养基（不含有血清的培养基）进行培养，根据细胞情况，大概12个小时以后，离心，去掉细胞碎片，取上清，就能提取到分泌蛋白了。
血清样品
1）血浆样品：可以通过医院常用的EDTA抗凝管进行收集，收集到的血浆会呈悬浮状态，离心去掉血细胞。
2）血清样品：现在大部分研究都直接针对血清样品，它的成份更简单，没有凝集素，没有大量的血细胞，针对性会更强。收集血清样品时，直接把血清吸到管子里，室温静置让它凝结，上清黄色部分就是血清样品啦。
好，我们收集好样品后，接下来就开始做样品前处理了。它分几步走呢？看下图：
对于以上这些步骤，后面会详细聊，这里我们先做点儿背景铺垫，大伙儿心里先有个谱：
铺垫
铺垫之一：第二步“充分溶解蛋白”尤为重要，如果蛋白没有充分溶解，能提取到的蛋白就会很少，达不到研究目的。
铺垫之二：在第一、二步，即破碎样品和溶解样品的过程中，为了减少人为操作引入的修饰，通常会准备大量的冰，进行冰上的操作。同时还需要加入蛋白酶抑制剂，防止在操作过程中蛋白被样品中自带的蛋白酶降解掉。
说到样品中自带的蛋白酶，尤其要高度重视的是胰腺样品，如果你在室温下解冻，整个样品可以直接化成水。胰腺本身含有非常丰富的胰蛋白酶，在体外的室温环境下，胰蛋白酶的活性没有谁来抑制它，于是可以完全释放天性，把组织样品里的蛋白都分解掉了！所以针对胰腺样品，要非常小心，必须在冰上操作，利用低温环境控制蛋白酶的活性。
铺垫之三：关于第三步“解旋蛋白质”。通常，蛋白质都是成球状的稳定状态，解旋蛋白质就是将球状蛋白中的二硫键打开，让它形成链状结构，以便进行下一步酶切。以下图胰岛素结构图为例，胰岛素分子通过很多二硫键形成稳定的球状结构，亲水基团主要集中在表面，而疏水基因都包裹在里面，如果用特异性酶直接作用于这些球状蛋白，包裹在里面的序列就不容易被酶作用到，酶切的效率就会很低~
如果能将这些二硫键打开，球状结构被破坏，蛋白分子就会变成链状，酶切位点才能尽可能多地暴露在酶环境里，这时候我们再加入特异性酶，就能得到更多的酶解肽段。
铺垫之四：对于第五步去除杂质，其实伴随着整个预处理的过程。杂质都是从哪里来的呢？比如，从组织中带来的杂质，提取溶液、酶解样品中带来的盐等。我们要知道，质谱是一个非常灵敏的仪器，它检测的是多肽的质荷比。所有的盐类，以及所有会进行离子化的杂质，都会干扰到肽段的检测。所以我们会要求进入质谱之前的蛋白样品非常干净。在蛋白水平及肽段水平都会进行去除杂质的步骤。
样品的破碎
好，接下来我们就从破碎样本开始，详细聊聊每一步具体应该怎么做，需要用到哪些方法、工具和试剂，以及操作的技巧和需要注意的那些小细节。
第一步 破碎样品
样品破碎的方法主要分三类：
机械破碎
1）液氮研磨：适用于大部分组织样品，比如常见的胃脏样品、肠样品、肝脏样品等。把所有的器皿、研钵，以及样品，都放到-80℃环境下，然后把样品放到研钵里，倒入液氨，整个样品会冻得非常脆，然后就大力研磨，直到磨成粉末。
2）匀浆：适用于亚细胞器的破碎，使用Dunce匀浆器。注意哈，匀浆没有液氨研磨那么剧烈，除亚细胞器以外的蛋白提取，通常还是建议用液氨研磨，破碎得更充分一些。
3）捣碎法：用研磨的方法破碎样品，如果样品量又大，那可是件非常辛苦的事情！于是一些公司推出了细胞破碎仪，利用玻璃珠或者磁珠剧烈地震荡，或者用刀片高速旋转，总之，用电力代表人力，帮助我们做样品破碎。
物理破碎
1）温差法：通常用于含有细胞壁的样品，比如一些细菌样品，利用高温和低温的反复变化，破坏细胞壁。
2）压力差法：适用于组织样品，通过高压和低压的反复变化，实现对组织样品的破碎。
3）超声破碎法：适用于细胞层次的样品。
化学处理
使用各种水解酶、变性剂或表面活性剂等，破碎细胞的膜结构，导致细胞的破碎。
事实操作中呢，我们通常会将几种方法结合起来使用。比如先液氨研磨，拿去提取蛋白，检测一下蛋白含量，发现破碎不够充分，于是又再用超声的方法，或者结合比较强的变性剂的方法等等，增强样品破碎的程度，释放更多的蛋白。
说到化学处理法，我们来看看样品前处理中会用到哪些抽提试剂吧。
上面列出的一些重要的试剂，我们来详扒一下：
8M尿素：这是比较强的变性剂，有时也会用6M尿素。
需要注意的是，在加入8M尿素以后，所有处理过程不能超过37℃，否则会将蛋白质的氨基胍基化，影响蛋白质的理化性质，影响后续的酶解，以及质谱检测，后果很严重！另外，如果这一步你用了8M尿素，后面又要用胰酶来做酶解，那么加入胰酶之前，一定要先将尿素稀释到1M，否则高浓度的尿素会让胰酶也变性，失去活性。
硫脲：能起到助溶的效果，也是一种还原剂，它的还原性与一些试剂盒是不兼容的，比如BCA试剂盒。
Tips: 处理过程中,我们要注意每一步的溶剂是否与下一步的溶剂兼容（兼容的意思就是，能不能一起使用）。根据它们的兼容性来进行选择。
4%SDS：很强的去污剂，但与胰酶不兼容，并且很难通过超滤的方法脱去的，它在超滤脱盐的过程中仍保留在蛋白样品中间。对于这类去污剂，我们通常会利用有机溶剂来去除它们，比如丙酮沉淀。
Tips: 这些去污剂，在样品进入质谱前都要去除干净，否则它们会在质谱的电场下离子化，影响我们的分析。因此呢，去污剂要慎用！
还原剂：功能是打开二硫键，使蛋白分子尽量从球状变成链状，增加蛋白质的溶解性，以及暴露出尽可能多的酶切位点。
蛋白酶抑制剂：夏天尤其需要，当温度比较高的时候，酶的活性也会较高，蛋白样品很容易发生自降解。如果做特殊样品的处理，比如磷酸化样品或其它翻译后修饰样品的富集，要针对性地加入这一类酶的抑制剂。
有机试剂：用来沉淀蛋白质，去除杂质。比如前面提到的去污剂，我们就可以利用有机试剂来去除它们；另外，针对植物样品或昆虫样品，样品本身含有很多色素，比如叶绿素，昆虫翅膀上的色素等，也可以用有机试剂将色素溶解掉，然后进行洗涤。
特别注意：整个处理过程中，所有使用的EP管、枪头、装试剂的塑料瓶，都尽量用进口的产品，尤其是当使用到强溶解性的溶液！国产的EP管上的材料（聚乙二醇）很容易被这些溶液洗脱下来，进入样品中，并且很难洗脱掉。而聚乙二醇非常容易离子化，会在质谱里形成很强的塑料峰，甚至会完全掩盖目标肽段的峰，造成检测的失败！
