2023年4月29日，bioRxiv发表了Peter N. Dodds团队题为“Pooled effector library screening in protoplasts rapidly identifies novel Avr genes”的研究论文。该论文提出了一个利用植物原生质体文库筛选快速鉴定R-Avr的平台。https://doi.org/10.1101/2023.11.21.567997
由于病原体毒力的快速进化，持久抗病性的作物育种具有挑战性。尽管近年来抗性 ( R ) 基因克隆和叠加方面的进展有所加快，但许多病原体中相应无毒 ( Avr ) 基因的鉴定因缺乏高通量筛选方案而受到阻碍。为了解决这一技术差距，我们开发了一个平台，用于植物原生质体中的混合文库筛选，以快速识别相互作用的R / Avr对。我们通过筛选设计的针对单个R基因的推定效应子文库，从小麦秆锈病菌中分离出已知和新型的Avr基因，从而验证了该平台。为快速Avr基因鉴定提供了分子工具，可通过基因型监测来了解和跟踪病原体毒力进化，并优化R基因部署和堆叠策略。该筛选平台广泛适用于许多作物病原体，同时也适用于筛选涉及其他原生质体选择性状的基因。
目前秆锈菌种仅鉴定到3个相应的Avr基因，分别是AvrSr27、AvrSr35、AvrSr50。其它锈菌中也仅在玉米锈菌P. sorghi中鉴定到AvrRppC和AvrRppK。
一般目前常用的鉴定Avr候选基因的方法包括通过 PEG 介导的原生质体转化或叶农杆菌渗透对单个R和Avr基因组合进行成对瞬时共表达，以检测免疫诱导的细胞死亡。然而，这些方法逐一分析候选效应子，实现难度较大，费时费力。随着测序技术的发展，高质量的病原菌基因组不断被测序、组装并发布。与此同时真菌和卵菌效应子预测的算法和各种工具不断涌现，这为设计和合成效应子文库提供了数据基础。基于此，作者开发一个用于在植物原生质体中筛选混合效应子文库，以便能够快速鉴定相互作用的R - Avr组合的平台。以加速无毒基因的鉴定工作。
简单理解就是准备好两组原生质体，一份转携带已知R基因的表达载体，一份转空载EV，然后再分别转染等量的效应子文库。如果有Avr能与已知R基因匹配，则原生质体破裂。随后通过收集两个群体的活原生质体进行靶向测序，通过比较两个群体的测序结果，如果与转染空载的群体相比，转染了R基因的群体中缺少哪个效应子，则初步鉴定为候选Avr基因。
但这一方法有诸多因素需要考虑。
1 转染效率的问题
一般原生质体转化都需要大提质粒，转染效率决定了实验的成功与否。随后他们测试了共转原生质体的效率，结果表明其实在使用高浓度质粒时，共转效率还是可以的，24%-40%。
2 死细胞的检测问题
以往对原生质体中免疫诱导的细胞死亡的测定依赖于荧光素酶报告基因与响应的R-Avr基因的共表达。这一试验方法的弊端在于，无法检测单个细胞的死亡情况，因为荧光素酶报告系统反应的时细胞悬浮液中综的荧光素蛋白酶活性。
于是，作者对上述方法进行改进。用YFP代替荧光素酶，并通过流式细胞术对转化的原生质体进行单独的荧光分析。试验发现：与表达单个R或Avr基因或不匹配的R-Avr对的对照相比，三个已知的小麦秆锈菌R-Avr配对Sr50-AvrSr50、Sr27-AvrSr27-2和Sr35-AvrSr35的共表达导致活细胞（碘化丙啶阴性，碘化丙啶只能对死细胞染色，无法穿透或细胞膜对活细胞染色。）群体中YFP阳性原生质体的比例显著降低。该测定允许定量原生质体悬浮液中显示免疫诱导的细胞死亡的细胞比例。
即使低浓度，也有差异，可以说这一方法对细胞死亡大致定量了。
3 通过缺失表达或差异表达能否独立筛选出Avr
作者测试了差异效应基因表达是否可用于鉴定Avr候选基因。为此，我们用模拟文库转化原生质体，该模拟文库由编码AvrSr50、AvrSr27-2（每个以0.14M的MOT递送）和AvrSr35（以100M的MOT）的三个构建体以及Sr50、Sr27或空载体（以36M）组成。转染后24小时原生质体中Avr基因表达的RNA-Seq分析（图2c）显示，当模拟文库与空载体共转化时，AvrSr27-2和AvrSr50都表达。然而，当与Sr50但不与Sr27共表达时，AvrSr50的表达显著降低，并且当与Sr27而不与Sr50共表达时AvrSr27-2的表达降低。这清楚地表明，当作为模拟文库的一部分共同递送时，每个Avr基因的作用可以通过它们的相对表达来独立评估。
牛刀小试
试验1
在建立并优化了文库筛选的实验条件后，合成了一个由696个预测的Pgt效应子组成的文库，这些效应子选自Pgt21-0参考基因组注释，作为编码分泌蛋白的基因，其表达模式类似于已知的Avr基因。将该文库合并并与空载体或编码Sr50、Sr27、Sr13c、Sr21、Sr22、Sr26或Sr61的七个分离的R基因构建体之一共转化（每个构建体MOT 0.14M）到原生质体中。使用RNA-Seq分析来鉴定当与相对于空载体的特定R基因共表达时表现出降低表达的效应物。两个独立的筛选正确地将AvrSr50鉴定为仅在Sr50存在下表现出显著降低表达的单个基因。
试验2
因此，从筛选的七个Sr基因中的四个中鉴定Avr基因候选代表高检测率，并且合成更大的效应文库可以允许鉴定额外的候选。
试验3
Sr13c和Sr22分别对AvrSr13和AvrSr22候选物的特异性识别通过原生质体与单个Avr候选基因和相应的R基因的共转化得到证实，与单独的R或Avr基因相比，这导致YFP阳性细胞的显著减少。
试验5
类似地，在来源于表达Sr13c或Sr22的稳定转基因小麦系的原生质体以及来源于表达Sr13a或Sr22的天然小麦系的质体转化后，也观察到这些Avr候选基因的特异性识别。
试验6
烟草和本氏N.benthamiana中的瞬时农杆菌表达测定也显示，当AvrSr13与Sr13c或AvrSr22与Sr22共表达时，细胞死亡诱导，但不与不匹配的R-Avr基因对共表达时。
AvrSr13由PGT21_021053在PGT21-0基因组参考的1A号染色体上编码，1B号染色体上的一个无效等位基因表明该菌株对Sr13无毒性是杂合的。然而，Ug99 Pgt分离株（小种TTKSK）在A和C单倍型中对相同的AvrSr13基因（PGTUg99_007363，未标记）是纯合的，因此可能对Sr13无毒性是纯合。AvrSr22由PGT21-0基因组参考中染色体16B上的PGT21_017626编码，并且PGT21-0中染色体16A上的替代等位基因包含未注释的相关序列，但编码与AvrSr21具有9个氨基酸差异的成熟蛋白。来自Pgt21-0吸器和受感染植物样品22的RNA-seq定位数据证实了该转录物在感染期间的表达水平与AvrSr22相似，表明它是一个我们指定为AvrSr22b等位基因的功能基因。Ug99基因组包含与AvrSr22（PGTUg99_032354）和AvrSr22b（tig00002160，未标记）相同的序列。
AvrSr22b与Sr22在小麦原生质体中的共表达导致YFP阳性原生质体的比例降低，并在瞬时转化的烟草和本氏烟草叶片中诱导细胞死亡。由于两个AvrSr22等位基因都被Sr22识别，因此Pgt21-0和Ug99可能是Sr22无毒性的纯合子。Ug99菌株对Sr13c和Sr22的无毒性是纯合的，这一观察结果表明，与Sr27、Sr35或Sr50相比，这些抗性基因更有可能对Ug99衍生的Pgt菌株提供持久的抗性，其中该菌株对无毒性是杂合的。
例如，Ug99茎锈病菌株对Sr13c和Sr22识别的Avr基因的纯合性为在育种计划中优先考虑这些抗性基因和针对该种族群体的持久抗性的R基因堆叠方法3提供了基本原理。这里开发的原生质体文库筛选平台也可以用于鉴定控制原生质体中具有可检测表型的其他重要生物性状的基因，或者与细胞死亡/存活或荧光报告基因输出有关的基因。
利用这一方法或可加速许多关键植物病原菌avr基因的鉴定和克隆。利用R-Avr这一基本原理，或可为加速和改进育种提供基础信息。
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