CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 Month 4 --可能的收官之帖（但还远未结束）

我的CRISPR-Cas9基因敲除系列实验推文好久没更新了，中间遇到了不少问题，好在都算是一一解决了，细胞在今天早上也已经送出去做测序验证了，希望能有比较好的结果。今天将会把我整个CRISPR-Cas9实验的过程以及思路放在这里。

--Part 1 开始前的碎碎念

我从2月28号开始正式做CRISPR-Cas9基因敲除实验，并不包括前期的sgRNA设计以及引物等待的时间，且本实验室已有前人构建了较为成熟的CRISPR-Cas9基因编辑系统，因此相关的试剂和耗材没有耗费我太多的精力，个人认为这一点是非常重要的。对于我而言，这4到5个月的时间是对CRISPR-Cas9从零开始，边做边学的一个死磕的过程。很多时候是箭在弦上，不得不发。以下是我遇到的困难总结：
1. 缺乏所有的相关背景知识：这一点在我看张峰老师组的文章的时候，最为明显。因此花了大量的时间查看中英文文献以及推文，甚至自己也在总结写推，即使是这样，随着实验的推进，不知道的东西越来越多，只能兵来将挡水来土掩，这个背景知识的学习过程，任何人都无法代替且非常重要，因为缺乏背景知识，就算有师兄指导，自己也不能很好的吸收。
2. 对整个分子克隆系统的不熟悉：在这之前我从未做过分子克隆相关实验，例如：载体构建，酶切实验，质粒转化、扩增和提取，更别说相关的背景知识了。因此又补充了质粒结构，golden gate还有Gibson assembly等相关知识。可以说在这4个月期间我做得最多的一套操作就是。基因组DNA/质粒提取或者扩增--PCR--切胶回收--酶切跑胶--再次切胶回收--assembly--感受态转化--挑单克隆扩增--质粒提取，酶切验证等等。这一系列实验花费了大量的精力并且大幅占据了实验记录本（因为我不仅仅是只做CRISPR-Cas9简单敲除，还在学习其他基因编辑方法）。
3. 对基因编辑系统的理解：一开始是看张峰老师组的文章，但是各个实验室在某些步骤上都有自己的偏好和概统。因此当我结束上一个实验，准备进入下一步的实验的实验，师兄说我们不这么做，我们做XXX，然后就懵了。刚开始的感觉就是，当天到底做啥都是在做之前几个小时或者提前一天才知道，真正的箭在弦上，不得不发。更换实验步骤和方法，意味着我预先准备的试剂耗材或者说是protocol是用不着的，需要紧急熟悉新的protocol，而且protocol还需要师兄过目（这一点就是有人指导的好处），并且点好关键步骤之后才能往下做。

解决困难的办法：
1. 不抗拒，享受补充背景知识的过程。在这里非常感谢导师能给予非常大的耐心，也感谢师兄给予的指导，虽然他们都看不到我的推啦~先看中文快速熟悉后再看英文，效果会更好。
张峰老师组的文章还有addgene上的poster或者小推文，非常的重要，必学！必要时还可以结合视频进行理解
2. 厚脸皮，就算被人家说怎么啥也不懂，也不要有心理压力，毕竟这是真的。有问题查了资料不能解决就问，问到了就好好学，转化为自己的知识就够了。今天中午吃饭的时候带我的师兄第一次夸了我，说你整理得挺清楚的（我今天大汇报），真是激动一脸，感谢师兄DZ。
3. 所有可以用到的资源一个都不放过，因此在早期的时候，果子老师，还有我好友铁丝、喜糖、大锅头等都是被我常常骚扰的，常常大晚上给人家留言问问题，而他们则显示出了优秀学者严谨、细致又认真的习惯和风度，从不同角度给了我指导。不仅是背景知识，甚至在我烦躁的时候还会有一点心理按摩，在大方向上也会给我点明，让我少走了不少弯路。得嘞，欠你们螺蛳粉了。

--Part 2 正文开始

背景知识准备

参考文献
（1）张峰老师组最全面的CRISPR/Cas9 protocol （我的前期推文已有相应解读）:
Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening
（2）Addgene网站相关poster和推文
（3）中文推文
试剂耗材准备
（1）细胞：293T工具细胞，目的细胞，DH5α、stal3感受态细胞（可自行制备，详见附件protocol）
（2）试剂盒：质粒小提、基因组DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒--均来自天根生物
（3）试剂：X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent-Roche （推荐），lipofectamine 3000 （life 公司），CloneR，ROCK inhibitor（干细胞相关需要）
（4）质粒准备：常用Cas9-puro质粒
（5）限制性内切酶：实验室常用限制性内切酶，Golden gate assembly、Gibson assembly相关酶
（6）仪器准备：流式分选，IncuCyte活细胞工作站
（7）软件准备：Snapgene

流程及目录

确定要敲除的目的基因
sgRNA设计（详见文末我的sgRNA设计推文，该推文同时包含PCR引物设计流程），并交由公司合成；需要同时提交PCR引物订单（见附件protocol-1）
将sgRNA克隆至Cas9-puro质粒中，并使用酶切验证（见附件protocol-2，3）
（1）在BbsI酶的作用下，使用golden gate方法将sgRNA克隆到Cas9质粒；
（2）将连接产物转化感受态细胞，涂平板，过夜培养12-16小时；
（3）挑取单克隆扩增12-16小时；
（4）质粒提取后酶切并琼脂糖凝胶电泳验证。
将Cas9-puro-gene质粒转染至293T细胞（24孔板即可），48/72小时后达到>70 %转染效率
（1）基因组DNA提取；
（2）Q5 PCR（这里的Q5是指NEB公司的高保真DNA聚合酶，详见附件protocol-4）
（3）凝胶电泳Q5PCR产物，并将目的基因条带切下，胶回收试剂盒提取DNA条带（详见胶回收试剂盒说明书，未附上，需要根据实验室试剂盒查找）
（4）NEB公司T7 Endonuclease I 酶切验证是否有基因突变（详见附件protocol-5）
（5）验证结果OK后进行正式实验

将Cas9-puro-gene质粒转染至目的细胞（普通细胞或肿瘤细胞使用Roche公司转染试剂集合，干细胞等难转细胞需要使用特殊试剂或者电转），参照各转染试剂说明书即可
根据转染效率进行筛选：>70 %，直接种96孔板进行单克隆培养（每个孔只种一颗细胞，注意，需要实时拍照观察）

如转染效率非常低，可使用FACS富集后，再进行单克隆培养，大约1-2周后，单克隆成团，将单克隆细胞移至24孔-6孔板扩增。

western blot验证敲除效率
（1）使用说明书推荐的阳性细胞验证抗体
（2）WB检测目的细胞蛋白表达
（3）蛋白表达量太低无法识别时使用免疫荧光检查
（4）需要注意一些蛋白是在特殊刺激下才有表达，需要预处理方可验证到，请提前看好文献
验证成功后
（1）基因组DNA提取
（2）Taq PCR扩增目的条带，胶回收试剂盒回收目的DNA
（3）目的DNA连接T载体，转化至感受态细胞，涂平板过夜培养
（4）挑选单克隆、扩增，菌液PCR验证
（5）提取质粒，送公司测序
最终结果查看

略

--Part 3 葫芦

昨晚回去想了想，觉得网络上详细的实验步骤不是没有，各种学习教程比比皆是，但是零基础初识CRISPR-Cas9的人怎么样才能做下来一个实验。因此，我的教程必须是可以使得零基础的人跟随着步骤，结合自己搜索的实验protocol，一步一步做下来。而去哪里获取合适的protocol呢？试剂公司的说明书永远是最好的，在这一整条流程中，各种质粒提取，转化酶切，都可以查阅到相关说明书，例如：