刘小泽写于19.10.26-27，更新于2020-06-23，最近会继续整理这本资料
为何取名叫“交响乐”？因为单细胞分析就像一个大乐团，需要各个流程的协同配合

分析单细胞数据，常见的一个名称就是SingleCellExperiment或者sce，那么这次就来认识一下这个基础知识点

前言

我们首先要对单细胞分析的流程有一个大概的认识：

上半场分析：

这个差不多属于固定的流程了

• 首先是数据导入

• 紧接着进行质量控制和归一化，这个步骤包含了矫正实验因素以及其他影响因素，目的是从raw count得到clean count

• 有了clean count，就要挑取导致表达量差异的基因们（用于后面的降维）
  因为降维的过程其实就是去繁存简，每个基因的变化都对整体有影响，对细胞来讲都是一个变化维度。但这么多维度我们看不了也处理不了，需要尽可能保证真实差异的前提下减少维度的数量，因此需要挑出那些更能代表整体差异的基因

  
  

• 降维

下半场分析：

这个就可以分出很多分支，例如

• 分群（clustering）：意在探索如何把scRNA数据集给拆分掉，变成一小块一小块的数据，这每一小块基因变化都是相似的
• 差异分析（differential expression）：不同组的细胞之间表达量差异是如何产生的
• 数据集的整合(Integrating datasets)：scRNA数据集越来越多，数据集之间的比较也日益显著
• 处理大型数据（large scale data）：这部分仅仅依靠内存存储的数据是不够的，还有更好的办法
• 还有：轨迹推断、细胞周期推断等等特定需求

知道了大体的流程，那么就先看看必须了解的数据结构

这是单细胞分析中的非常常用的S4对象，里面包罗万象，但依然有据可循。那么它是如何组织的？存储了什么内容？这就是我们这次要探索的任务。内容来自：https://osca.bioconductor.org/data-infrastructure.html

首先要上一张图

这张图会不断反复查看

图中最核心的部分，是蓝色的data部分；另外还有绿色的基因注释信息feature metadata、橙色的细胞注释信息cell metadata。除了这三大件，还会包含一些下游分析结果，比如PCA、tSNE降维结果就会保存在紫色的Dimension Reductions

这个SingleCellExperiment对象来自SingleCellExperimentR包，现在Bioconductor上的70多个单细胞相关的R包都使用了这个对象，可以说是单细胞领域的通用货币，包含了： gene-by-cell expression data、 per-cell metadata 、 per-gene annotation

开始发挥想象力了哈！

如果把这个SingleCellExperiment对象比作一艘货船，上面就会装载许多集装箱slots（理解为对象结构） 。每个箱子slot都是独立的，箱子里面包含的东西不一样，比如有的装食物，有的装砖头，各有各的特征。就sce来说，有的接口必须是数值型矩阵结构，有的就需要数据框结构。

核心部分-assays

创建一个sce对象很容易，只需要一个assays就可以，这是一个列表，其中包含了许多表达数据，例如原始数据count或者其他标准化处理过的数据，行是基因，列是样本

可以构建一个10个基因，3个细胞的矩阵【一定要是矩阵】

counts_matrix <- data.frame(cell_1 = rpois(10, 10), 
                    cell_2 = rpois(10, 10), 
                    cell_3 = rpois(10, 30))
rownames(counts_matrix) <- paste0("gene_", 1:10)

counts_matrix <- as.matrix(counts_matrix) 

有了这个，就可以用一个list构建出SingleCellExperiment对象。当然，这个list中可以包括任意个矩阵

# BiocManager::install('SingleCellExperiment')
sce <- SingleCellExperiment(assays = list(counts = counts_matrix))

>sce
## class: SingleCellExperiment 
## dim: 10 3 
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
## rowData names(0):
## colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
## colData names(0):
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):

为了得到这个对象中的矩阵，可以用两种方式获得：

• assay(sce, "counts")：这个方法是最通用的办法，而且其中的counts可以换成其他的名称，只要是出现在之前的list中都可以
• counts(sce)：它实现的东西和上面一样，只不过这个方法只适合提取counts这个名称的矩阵

counts(sce)
# 或者assay(sce, "counts")

##         cell_1 cell_2 cell_3
## gene_1       7      9     35
## gene_2       7      6     38
## gene_3      10     14     32
## gene_4       7      9     32
## gene_5      19     19     48
## gene_6       8      7     26
## gene_7      10     10     28
## gene_8       4     10     26
## gene_9      10      9     37
## gene_10      6     16     26

assays还能扩展

既然有了核心，那么就可以根据它进行多向拓展，这也是它强大的一个原因。

使用标准函数扩展

之前assays中只有原始表达矩阵，其实还能根据它扩展到归一化矩阵，例如使用一些R包的函数对包装的矩阵进行操作：

sce <- scran::computeSumFactors(sce)
sce <- scater::normalize(sce)

> sce
## class: SingleCellExperiment 
## dim: 10 3 
## metadata(1): log.exprs.offset
## assays(2): counts logcounts
## rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
## rowData names(0):
## colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
## colData names(0):
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):

这样，assays 就从一个存储原始矩阵的counts ，又扩增了归一化矩阵的logcounts 。同理，这个logcounts也是能有两种提取方法：

logcounts(sce)
# assay(sce, "logcounts")

##         cell_1 cell_2 cell_3
## gene_1    3.90   3.95   4.30
## gene_2    3.90   3.41   4.41
## gene_3    4.38   4.55   4.18
## gene_4    3.90   3.95   4.18
## gene_5    5.28   4.98   4.73
## gene_6    4.08   3.61   3.89
## gene_7    4.38   4.09   3.99
## gene_8    3.16   4.09   3.89
## gene_9    4.38   3.95   4.37
## gene_10   3.69   4.74   3.89

通过对比这个logcounts和counts数据，就能发现为什么要做normalization这一步：原始矩阵中1、2表达量差不多，但和3差别很大，很有可能是细胞3本身测序深度就比较高，因此得到的reads数也多；进行归一化以后，应该就去除了样本文库差异，结果看到1、2、3之间也变得可比了

到目前为止，我们总共得到了：

assays(sce)

## List of length 2
## names(2): counts logcounts

自定义扩展assays

这里的自定义指的是，我们不使用某个R包的某个函数，而是根据自己的想法，去根据原始矩阵得到一个新的矩阵

# 例如自己创建一个新的counts_100矩阵，然后依旧是通过这个名称进行访问
counts_100 <- assay(sce, "counts") + 100
assay(sce, "counts_100") <- counts_100 

看一下结果【注意：新增用的是assay单数，查看结果用的是assays复数】

assays(sce)
## List of length 3
## names(3): counts logcounts counts_100

小结

再回到第一张图，看看assays那里，是不是画了深蓝和浅蓝？这也是为了更好地表达：assays可以包含多个矩阵；构建sce对象可以一次一次加入新的矩阵，也可以用列表的形式，一次加入多个矩阵

列的注释信息：colData

之前有了”核心“——表达矩阵信息，那么其次重要的就是添加注释信息，这部分来介绍列的注释，针对的就是实验样本、细胞。这部分信息将会保存在colData中，它的主体是样本，于是将行名设定为样本，列名设为注释信息（如：批次、作者等等），对应上面图中的橙色部分。

接下来先设置一个细胞批次注释信息：

cell_metadata <- data.frame(batch = c(1, 1, 2))
rownames(cell_metadata) <- paste0("cell_", 1:3)

有了注释信息，怎么把它加入sce对象呢？

两种方法：一种是直接构建，一种是后续添加

• 直接构建：

  sce <- SingleCellExperiment(assays = list(counts = counts_matrix),
                             colData = cell_metadata)
  

• 后续添加

  colData(sce) <- DataFrame(cell_metadata)
  

然后看看sce对象添加了什么：

可以看到colData增加了之前设置的batch信息

sce
## class: SingleCellExperiment 
## dim: 10 3 
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
## rowData names(0):
## colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
## colData names(1): batch
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):

加入了sce对象以后，怎么获取它呢？

colData(sce)
## DataFrame with 3 rows and 1 column
##            batch
##        <numeric>
## cell_1         1
## cell_2         1
## cell_3         2

或者直接看结果信息：

sce$batch
## [1] 1 1 2

这个注释信息只能自己手动添加吗？

答案是no！有一些包可以自己计算，并且帮你添加进去。例如scater包的calculateQCMetrics()就会帮你计算几十项细胞的质量信息，结果依然是使用colData调用注释结果信息

sce <- scater::addPerCellQC(sce)
colData(sce)[, 1:5]
## DataFrame with 3 rows and 5 columns
##            batch       sum  detected percent_top_50 percent_top_100
##        <numeric> <integer> <integer>      <numeric>       <numeric>
## cell_1         1        80        10            100             100
## cell_2         1        88        10            100             100
## cell_3         2       309        10            100             100

还能任意添加

sce$more_stuff <- runif(ncol(sce))
colnames(colData(sce))
sce$more_stuff
## 0.04094262 0.41983904 0.51959352

既然colData可以包含这么多的注释信息，那么怎么从中选取一部分呢？

colData的一个常用操作就是取子集，看下面操作：

例如想从colData中选择批次信息，和数据框取子集是类似的

sce$batch
# 或者colData(sce)$batch

## [1] 1 1 2

然后如果再想取批次中属于第一个批次的信息，就可以继续按照数据框的思路取子集：

sce[, sce$batch == 1]

## class: SingleCellExperiment 
## dim: 10 2 
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
## rowData names(0):
## colnames(2): cell_1 cell_2
## colData names(9): batch sum ... total more_stuff
## reducedDimNames(0):
## altExpNames(0):

这样看的colnames中就只剩两个细胞了

行的注释信息：rowData/rowRanges

既然样本有注释信息，那么同样的，基因也有自己的注释，它就存放在rowData或者rowRanges中，这两个的区别就是：

• rowData：是一个数据框的结构，它就存储了核心assays矩阵的基因相关信息

  它返回的结果就是这样：

  # 一开始rowData(sce)是空的，可以添加
  sce <- scater::addPerFeatureQC(sce)
  rowData(sce)
  
  ## DataFrame with 10 rows and 2 columns
  ##              mean  detected
  ##         <numeric> <numeric>
  ## gene_1    16.0000       100
  ## gene_2    14.3333       100
  ## gene_3    16.0000       100
  ## gene_4    18.6667       100
  ## gene_5    15.3333       100
  ## gene_6    16.6667       100
  ## gene_7    17.6667       100
  ## gene_8    13.0000       100
  ## gene_9    16.6667       100
  ## gene_10   14.6667       100
  

• rowRanges：也是基因相关，但是它是GRange对象，存储了基因坐标信息，例如染色体信息、起始终点坐标

  它返回的结果一开始是空的：

  rowRanges(sce) 
  ## GRangesList object of length 10:
  ## $gene_1
  ## GRanges object with 0 ranges and 0 metadata columns:
  ##    seqnames    ranges strand
  ##       <Rle> <IRanges>  <Rle>
  ##   -------
  ##   seqinfo: no sequences
  ## 
  ## $gene_2
  ## GRanges object with 0 ranges and 0 metadata columns:
  ##    seqnames    ranges strand
  ##       <Rle> <IRanges>  <Rle>
  ##   -------
  ##   seqinfo: no sequences
  ## 
  ## $gene_3
  ## GRanges object with 0 ranges and 0 metadata columns:
  ##    seqnames    ranges strand
  ##       <Rle> <IRanges>  <Rle>
  ##   -------
  ##   seqinfo: no sequences
  ## 
  ## ...
  ## <7 more elements>
  

怎么按行取子集？

同样类似于数据框，可以按位置、名称取子集：

sce[c("gene_1", "gene_4"), ]
# 或者 sce[c(1, 4), ] 

## class: SingleCellExperiment 
## dim: 2 3 
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(2): gene_1 gene_4
## rowData names(7): is_feature_control mean_counts ... total_counts
##   log10_total_counts
## colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
## colData names(10): batch is_cell_control ...
##   pct_counts_in_top_200_features pct_counts_in_top_500_features
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):

看到rownames结果就剩2个基因

除了以上3大块，还有一些重要的”集装箱“需要介绍，这些前面用附标识

附1：对样本进行归一化：sizeFactors

这里面装了根据样本文库计算的文库大小因子，是一个数值型向量，用于后面的归一化

sce <- scran::computeSumFactors(sce)
sizeFactors(sce)
## [1] 0.5031447 0.5534591 1.9433962

# 或者手动添加
sizeFactors(sce) <- scater::librarySizeFactors(sce)
sizeFactors(sce)
##    cell_1    cell_2    cell_3 
## 0.5031447 0.5534591 1.9433962

前面提到的： assays (primary data), colData (sample metadata), rowData/rowRanges (feature metadata), and sizeFactors 。其实这其中前三个都来自于SummarizedExperiment这个对象。基于这个对象，还建立了一些新的对象接口，例如下面👇的：

附2：降维结果：reducedDims

存储了原始矩阵的降维结果，可以通过PCA、tSNE、UMAP等得到，它是一个数值型矩阵的list，行名是原来矩阵的列名（就是细胞、样本），它的列就是各种维度信息

它和assays一样，也可以包含许多降维的结果，例如用scater包计算PCA：

sce <- scater::logNormCounts(sce)
sce <- scater::runPCA(sce)
# 这个算法是利用了sce对象的归一化结果logcounts(sce)
reducedDim(sce, "PCA")
# PC1        PC2
# cell_1 -0.6897959 -0.4080860
# cell_2  0.8493039 -0.2145128
# cell_3 -0.1595080  0.6225988
# attr(,"percentVar")
# [1] 67.07301 32.92699

除了PCA，tSNE的结果也是存储在这里：

sce <- scater::runTSNE(sce, perplexity = 0.1)
reducedDim(sce, "TSNE")
##               [,1]      [,2]
## cell_1    35.64851  5694.164
## cell_2 -4951.13619 -2815.978
## cell_3  4915.48768 -2878.186

看下全部的结果都包含什么：

reducedDims(sce)
## List of length 2
## names(2): PCA TSNE

调取方法也十分类似：assay，数据矩阵存储在assays，而调用是assay；这里的降维结果存储在reducedDims，调用是reducedDim

这个降维信息只能自己手动添加吗？

答案也是no！和前面的counts_100加到assays的思路一样，我们也可以自己计算，而不用现成的函数，最后加到reducedDims这个接口。

例如，进行UMAP降维，虽然可以用scater::runUMAP()，但依然可以自己处理。

比如这里使用uwot包，不过这个包只能计算，不能添加到sce对象，需要手动添加：

u <- uwot::umap(t(logcounts(sce)), n_neighbors = 2)
reducedDim(sce, "UMAP_uwot") <- u

##              [,1]        [,2]
## cell_1 -0.3952368 -0.03182602
## cell_2  0.2347576  0.60432243
## cell_3  0.1604792 -0.57249641
## attr(,"scaled:center")
## [1]  7.596012 19.251450

最后再来看一下：

reducedDims(sce)
## List of length 3
## names(3): PCA TSNE UMAP_uwot

附3：metadata 接口

虽然前面介绍了许多接口，但还是有很多DIY的，不能直接导入它们，不过我们仍然需要这些信息，于是medata接口诞生。它可以存储任意类型的数据，只要给它一个名字。

例如，我们有几个感兴趣的基因（比如是高变化基因），现在想要把它保存在sce中，方便以后使用：

my_genes <- c("gene_1", "gene_5")
metadata(sce) <- list(favorite_genes = my_genes)

metadata(sce)
## $favorite_genes
## [1] "gene_1" "gene_5"s

既然是一个列表，就意味着支持扩展：

your_genes <- c("gene_4", "gene_8")
metadata(sce)$your_genes <- your_genes

metadata(sce)
## $favorite_genes
## [1] "gene_1" "gene_5"
## 
## $your_genes
## [1] "gene_4" "gene_8"

附4：spike-in信息

还是可以继续使用isSpike来添加，虽然会显示'isSpike' is deprecated：

isSpike(sce, "ERCC") <- grepl("^ERCC-", rownames(sce))

# 结果就会在sce中添加：
## spikeNames(1): ERCC

spikeNames(sce)
## [1] "ERCC"

table(isSpike(sce, "ERCC"))
# 就能看存在多少Spike-in

现在推出了：alternative Experiments

spike_counts <- cbind(cell_1 = rpois(5, 10), 
    cell_2 = rpois(5, 10), 
    cell_3 = rpois(5, 30))
rownames(spike_counts) <- paste0("spike_", 1:5)
spike_se <- SummarizedExperiment(list(counts=spike_counts))
spike_se
## class: SummarizedExperiment 
## dim: 5 3 
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(5): spike_1 spike_2 spike_3 spike_4 spike_5
## rowData names(0):
## colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
## colData names(0):

然后通过altExp()加入进来，它的操作和assays或reducedDims()类似：

altExp(sce, "spike") <- spike_se
altExps(sce)
## List of length 1
## names(1): spike

# 提取数据也是类似的
sub <- sce[,1:2] # retain only two samples.
altExp(sub, "spike")
## class: SummarizedExperiment 
## dim: 5 2 
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(5): spike_1 spike_2 spike_3 spike_4 spike_5
## rowData names(0):
## colnames(2): cell_1 cell_2
## colData names(0):

附5：对列添加label

使用colLabels() ，尤其在非监督聚类过程中对细胞添加label，进行分组

colLabels(sce) <- LETTERS[1:3]
colLabels(sce)
## [1] "A" "B" "C"

例如scran::findMarkers就是通过colLabels()来提取细胞信息的

小结

SingleCellExperiment对象兼容性很好，可以用于多个scRNA的R包的输入数据

中间分析的每一步都会向这个对象的assays, colData, reducedDims 等模块添加信息

这个对象方便了未来数据传输与协作，这本书的后续也会基于这个对象进行探讨

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