之前抄着gatk的Best Practices做了个somatic的流程，用的是gatk这个页面发布的ucsc.hg19.fasta（md5sum a244d8a32473650b25c6e8e1654387d6)。
在测试某赢给的标准品时，发现有一个经他们wes检验的位点，我这边无法call出。其实对于gatk这些疑似bug，我也见怪不怪了，之前查过gatk论坛，发现这情况不在少数，官方维护者似乎也给不出明确的答复，我倒是遇见过一些由于soft cliping原因出不来的位点(但这种位点是否要保留，我也不太清楚，这里贴个我请教过bcftool的链接)，总之gatk用个--alleles强制call，肯定是能出的。如果有想彻底弄明白的朋友，可以看看这两篇帖子
Why do a clear expected variant not show up in the Mutect2 vcf file – GATK
Mutect2 missing a low AF known deletion – GATK
回过头发现还是无法call出，到igv查看此位点，发现mapping质量为0，即匹配到参考基因组多个位置上。
而在运行mutect2时，在控制台上其实可以看到
显然，mutect2运行时，默认开启的过滤器将其过滤了，关闭mapq相关过滤器
-DF MappingQualityAvailableReadFilter -DF MappingQualityNotZeroReadFilter -DF MappingQualityReadFilter这样操作，结果当然是能凑出来。但是，由此也让人十分好奇这种大面积mapq为0的原因。
由于我igv用的不是太熟，不清楚有没有办法基于igv查是对比到了哪些序列，于是是在igv上复制了其中一条reads，在blat上比对。
比如
CTGGGCATGCAGGACCGGACCATCCCAGACAGTGACATCTCTGCTTCCAGCTCCTGGTCAGATTCCACTGCCGGCCGCCACAGCAGGTACTTGGCACACCTGGCACACTTGTAGCTGCCCCGAGAGGAGCTCCTGGGACCTCTACTTCCC
可以看到，这段序列匹配到了（其它一些十几bp的软剪切就不说了）
>chr6_qbl_hap6
>chr6_mcf_hap5
>chr6_mann_hap4
>chr6_dbb_hap3
>chr6_cox_hap2
>chr6_apd_hap1
>chr6
根据小道消息(https://springwood.me/ngs-somatic-mutation/)，只保留常染色体与性染色体，结果是全比上去了，甚至深度还和突变频率还都提高不少。
那么，我们可以简单粗暴地只要常染色体和性染色体吗？我想答案是否定的。
这一点，其实varsome给出了他们的答案Which reference genome is being used to align the reads? (varsome.com)
在学习gatk此网页后(Human genome reference builds - GRCh38 or hg38 - b37 - hg19 – GATK (broadinstitute.org)，也就可以了解其用意了,核心思想总之是，去除具有高度多态性的重叠区域,因为这些区域会影响比对质量。
那为什么不把chr_random和chr_un这些都删掉，反正我设计bed也没打算测它们，或许还能提高运行速度？
这时候就得考虑实际实验时候的脱靶了，chr_random和chr_un都是在人体内真实存在的序列，假设一个不小心，脱靶测到了这段，比对时候各归其位还好说。但倘若所用的参考序列里删了这些chr_random和chr_un，本该比到chr_random和chr_un的序列强行比对上保留的常染色体和性染色体，会有假阳的风险。如果觉得不太明白可以看biostars上的这个问题
到这里，问题也就解决了。后面在ucsc晃悠时，我才发现这个ucsc有对这个问题做出解决(http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/analysisSet/)
而且liheng大佬在17年就说这个事了(而我在22年还在全网狂搜.....),不过大佬推荐的是千人基因组的(https://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/technical/reference/human_g1k_v37.fasta.gz)，ucsc还专门贴了链接，知耻而后勇了可能是。
还有一点奇怪的是，gatk存档的ucsc参考基因组md5为 a244d8a32473650b25c6e8e1654387d6
http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/hg19.fa.gz 806c02398f5ac5da8ffd6da2d1d5d1a9
http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gz 7707462fc100c7d987c075bc146b16ae
和ucsc的两个版本都和其对不上，我个人猜测是初版--迭代版(gatk)--最新版的关系。
另外，云分析平台DNAnexus也有关于参考基因组的说明与推荐
目前看来，我用bwa的话直接下载
http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/analysisSet/hg19.p13.plusMT.no_alt_analysis_set.bwa_index.tar.gz
可能是最省事的，或者下载human_g1k_v37与hs37d5。
这边也看到一个比较全面的关于人类参考基因组的帖子
常用或特别的人类fasta参考基因组下载链接 - 知乎 (zhihu.com)
