Can Dis | 黑色素瘤恶化和免疫编辑的高精度空间图景

原创 huacishu 图灵基因 2022-04-19 09:14

收录于话题#前沿生物大数据分析

撰文：huacishu

IF=39.397

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亮点：

1、作者整合了3D高分辨率显微镜和空间转录组学来研究原发性黑色素瘤的免疫逃避和免疫编辑；

2、作者使用两种不同的转录组学方法（mrSEQ:GeoMx和PickSeq）对选定的区域进行转录谱分析。由此产生的分子和形态学数据随后与局部组织病理学相关联，从而保留不同组织学的空间关系并提供足够的统计能力。

哈佛医学院Peter K. Sorger教授课题组在国际知名期刊Cancer Discov在线发表题为“The spatial landscape of progression and immunoediting in primary melanoma at single cell resolution”的论文。皮肤黑色素瘤是一种高度免疫原性恶性肿瘤，早期可通过手术治愈，但转移时会危及生命。本文作者整合了3D高分辨率显微镜和空间转录组学来研究原发性黑色素瘤的免疫逃避和免疫编辑。作者发现，当肿瘤发生局部侵袭时，沿肿瘤间质边界形成一个稳固且空间受限的抑制环境。这种环境是由促进MHC-II和IDO1表达的细胞因子梯度，以及由涉及巨噬细胞、树突状细胞和T细胞的PD1-PDL1介导的细胞接触建立的。在几毫米之外，细胞毒性T细胞与黑色素瘤细胞在肿瘤消退领域形成突触。因此，入侵和免疫编辑可以在一个样本中共存，彼此之间的距离只有几毫米。

在11例原发性皮肤黑色素瘤、1例局部区域转移和1例远处皮肤转移的FFPE标本中，共鉴定出70个具有癌前或癌组织学的组织区域（组织学ROI）。对H&E染色标本进行分析，确认存在一到五个组织学ROI（每个标本平均2.4个），对应于前体区、原位黑色素瘤（MIS）、侵袭性黑色素瘤（IM）、外生性黑色素瘤（EM）和炎症消退（IR），彼此相隔约5-20 mm。连续FFPE切片（5µm厚）使用不同的抗体组合进行全向、亚细胞分辨率、20-30倍CyCIF成像，以生成互补的图像数据集（图1A-1C）。抗体包括泛细胞角蛋白（pan-cytokeratin，pan-CK）染色表皮中的角质形成细胞；SOX10和MITF染色正常和非典型黑素细胞及肿瘤细胞；平滑肌肌动蛋白（αSMA）染色基质细胞，CD31染色血管内皮细胞。免疫细胞用所述的谱系特异性细胞表面蛋白和功能标记物染色。图像分析和数据处理使用集成到开源MCMICRO管道中的算法进行；然后对CD4、CD8、CD163等谱系标记的染色强度进行定量，以区分13种免疫细胞类型（图1D-1F）。PD1受体和PDL1配体之间的极化相互作用也可以通过这种方式成像。为了估计这种相互作用的频率，对位于肿瘤-基质界面的两个高分辨率FOV进行了详细检查。共鉴定出199个细胞（15个PDL1+巨噬细胞和64个PD1+T细胞）；在58例中，这些细胞被判定彼此之间的距离在20µm以内。这些相互作用往往很复杂，涉及两个以上的细胞。例如，图1G和1H显示了一个SOX10+肿瘤细胞与两个CD8+细胞毒性T淋巴细胞和一个CD4+调节性T细胞接触。肿瘤细胞与其中一个CTL接触部位CD8（T细胞受体的共同受体）的极化与免疫突触的形成一致。在该CTL中，一些TIM3和LAG3部分定位于突触，尽管这些蛋白质的大多数被分类到细胞的另一侧（图1H，1I）。TIM3和LAG3是共同抑制受体，其功能是调节CTL的活性，它们在PD1+CTL上的存在表明这些细胞可能被激活或可能“耗尽”。通过肿瘤细胞和Treg之间的接触点进行光学切片也显示了一种接触（图1J），这种接触可能与耐受活性的编程有关。

为了确定在患者中复发并与肿瘤进展相关的免疫和肿瘤细胞相互作用的模式，使用了LDA。LDA是一种概率建模方法，可将混合实体的复杂组件简化为不同的组件社区（循环细胞邻域；RCN）。为了识别RCN，根据细胞类型和状态标记（例如增殖、调节、耗尽）在22个复杂CyCIF数据中的表达，将MEL1-MEL13中约1.7 x 106个信号细胞分配到12个基本类别中的一个（图2A）。这些数据在关键标记上表现出良好的信噪比（图2B）。在70个组织学ROI注释（疾病进展区域）中，与MIS和侵袭性黑色素瘤相比，正常或前体区域之间的S100A+SOX10+细胞百分比显著增加，与黑素细胞源性肿瘤细胞的增加一致（图2C）。根据不同ROI中的细胞组成和出现频率，对这些RCN进行注释，然后将其映射到原始样本中的物理位置（图2D）。

根据细胞组成，不同的RCN主要对应于表皮、黑素细胞、髓样细胞、T细胞和免疫抑制人群（图2E）。RCN1富含角质形成细胞（该RCN中70%的细胞），并与表皮共同广泛分布。RCN10含有最多的细胞（占所有定量细胞的38%），其中90%为SOX10+；这些主要对应于垂直生长期黑色素瘤区域的肿瘤细胞（图2D）。在RCN10中，肿瘤细胞密集地聚集在一起，只有少量浸润细胞（图3A和3B）。相比之下，RCN9（约占所有细胞的6.4%）含有等量的SOX10+细胞和免疫细胞（分别为36%和34%），对应于实体瘤和真皮之间的界面（图2D，3A-B）。在正常皮肤、相邻黑素细胞异型性区域以及SOX10+细胞聚集的区域也发现了孤立的RCN9和RCN10（图3C）。RCN9中最丰富的免疫细胞是CD11C+巨噬细胞和树突状细胞（80%），从前体到MIS再到侵袭性肿瘤，这一邻域的患病率显著增加，突出了富含髓系的肿瘤边界的形成（图3D）。在前体ROI中，富含髓系（RCN2，4）和富含PDL1（RCN5）的群体比相邻未受影响的皮肤或后期疾病阶段更接近RCN10。相比之下，在前体样本中，细胞毒性群体（RCN7）似乎比在MIS或IM中更接近RCN10（图3E）。为了证实这一发现，测量了黑素细胞和最近的PDL1+髓样细胞或CTL之间的距离。观察到两种细胞在正常期和前体期之间的距离都显著缩短。在前体区域，Tregs与黑素细胞的接近程度也显著降低（图3F）。

抗PD1治疗的成功证明了PD1-PDL1相互作用在黑色素瘤中的重要性。在13个样本的所有70个ROI中，约70%的CTL表达激活标记物PD1，但检测到很少有肿瘤细胞表达显著水平的PDL1，即使在基于转录谱的IFNɣ高度表达的肿瘤区域。在这些病例中，成像显示肿瘤细胞上的PDL1配体和CTL上的PD1受体共定位，与配体-受体结合一致（图4A）。与所有患者缺乏PDL1+肿瘤细胞相比，在70个带注释的组织学区域中的44个区域中，观察到PD1+CTL和PDL1+巨噬细胞及树突状细胞之间存在显著的共定位；这种共同发生的频率也随着疾病阶段的增加而增加（图4B）。在某些情况下，巨噬细胞通过从巨噬细胞延伸至少一个细胞直径（10µm）的细胞过程与CTL形成假定的抑制性突触（图4C），表明非相邻细胞可以彼此进行功能性接触。PDL1+髓样细胞的大量亚群也表达TIM3，这与免疫抑制有关（图4D和4E）。在这些标本中，PDL1+SOX10+肿瘤细胞丰富（估计为≥20%阳性）仅在一个样本中出现，在25个样本中的22个样本中不常见（0-5%阳性）（图4F和4G）。在原发性黑色素瘤中，表达PDL1最多的细胞是树突状细胞和巨噬细胞，而不是肿瘤细胞。

因为LDA检测细胞之间的离散差异，所以它对单一类型细胞之间的质量差异不敏感。为了量化这种差异，使用了主成分分析（PCA）和移位滞后分析，重点是侵袭性肿瘤中的细胞。得分图中的最高负荷是KI67、S100A和S100B蛋白以及MITF转录因子。在整个肿瘤中，S100A、S100B和MITF在浸润边缘处的蛋白质水平最高，EM的中间水平最低（图5A，5B）。空间滞后是地理学和生态学中一种常见的空间统计，利用它来根据蛋白质水平的持续差异识别复发性肿瘤细胞群落。空间滞后向量聚类显示存在10个肿瘤细胞群落（图5C和5D），它们在超维特征上彼此不同。尽管在少数情况下，单一标记物占优势：TCC3的MHC-II阳性和TCC8的MITFhigh KI67low状态（图5C和5D）。TCC1对应于S100A高MITFlow模式，主要在EM中发现，而TCC2中的MITFhigh细胞主要在IM中发现。TCC3和TCC4为MHC-II高或CCND1高，具有独特的空间定位（图5C和5D）。TCC8位于TCC3和TCC4的内部，TCC1和TCC2主要位于后缘的内部（图5E）。侵入前沿的TCC2群体由70%至85%的MITFhigh KI67high细胞组成（图5F）。实验证实成像的原发性黑色素瘤在MITF、NGFR和AXL表达上与大多数实验室研究中使用的黑色素瘤细胞系不同，其中大多数来源于转移性疾病。

为了研究与作者使用LDA和空间滞后分析确定的不同免疫邻域和肿瘤细胞群落相关的转录程序，使用PickSeq对样本MEL1的292个感兴趣的区域（mROIs）进行了转录组学（mrSEQ）分析（图6A）。常用于检测和分型恶性黑色素瘤的标记物（PMEL、MLANA、TYR、MITF和CSPG4）在肿瘤区域（EM和IM）的mROIs基因水平上都有强烈且一致的表达，偶尔在MIS中表达，而不是在免疫丰富区域（IR、bTIL）中表达，证实了这些区域的注释和方法的选择性（图6B）。MIS和IR附近的皮肤中富含角质形成细胞特征（图6C）。为了研究空间滞后分析揭示的垂直生长期黑色素瘤内空间异质性的分子决定因素，对MEL1的IM和EM结构域进行了差异表达（DE）分析；这在IM中发现了81个显著上调的基因，在EM中发现了69个上调的基因（图6D）。在IM中，GSEA显示KRAS信号和下游NF-κB和MYC程序显著富集（图6E和6F）。KRAS通路的上调预期发生在肿瘤中，如NF1中的突变型MEL1，其功能为RAS GTPase激活蛋白（GAP）。BCL2A1是BCL2基因家族的抗凋亡促生存成员，在IM中表达，但在EM中不表达（图6F）。EMT相关基因也有不同的表达：S100A4金属蛋白酶、β-连环蛋白和波形蛋白（DMKN、MMP2、CTNNB1和VIM基因）在IM中上调，GSEA分析证实了该区域内EMT相关特征的富集（图6G）。为了确定与肿瘤进展相关的差异表达基因，作者比较了肿瘤集合（EM+IM）和MIS的mrSEQ数据。然而，细胞成分的差异是该分析中的一个复杂因素：EM和IM主要含有肿瘤细胞，免疫细胞很少，但MIS除了肿瘤细胞外，还富含免疫细胞和角质形成细胞。为了纠正这种效应，作者搜索了一个通过成像和mrSEQ显示的基因，该基因在EM和IM的SOX10+肿瘤细胞中表达，但在MIS中不表达，然后构建了一个基于相关性的基因网络，以识别与该基因共表达的基因；S100B被认为是实现此目的的理想候选者（图6H）。由此产生的S100B相关模块包括35个基因，所有这些基因在EM-IM中均表现出统计上显著的上调（图6I和6J）。在这些基因中，通过CyCIF验证了CD63和PMEL在蛋白质水平上的上调（图6K）。这一基因集可能需要进一步分析，以改进目前通过基因集分析确定黑色素瘤风险的方法。

为了更好地了解原发性黑色素瘤的侵袭性（图7A），作者结合了mrSEQ、常规CyCIF和来自肿瘤MEL1的3D高分辨率去卷积显微镜。在侵入性边界（IB）区域，mrSEQ数据显示IFNɣ和JAK-STAT信号以及IFN诱导细胞因子CXCL10和CXCL11显著和局部上调（图7B）。与这一观察结果一致，IDO1在IB的空间限制性表达（图7B）。此外，肿瘤细胞的mrSEQ和CyCIF均显示MHC-II（HLA-DPB1）的空间限制性表达（图7C），已知其为IFNɣ诱导型。MHC-II与CD4+/CD8+T细胞上的LAG3结合，通过上调MAPK/PI3K信号，促进黑色素瘤的持续存在，还可以通过抑制FAS介导的凋亡促进免疫逃逸。因此，IB处存在一个严格限制的微环境，涉及多种细胞因子，这些细胞因子被JAK-STAT-IDO1通路诱导，从而形成高度局限性的免疫抑制环境。其他干扰素刺激基因（ISG）的表达，如IRF1和IRF5，在IB处也很明显：成像显示肿瘤细胞中有IRF1的核染色，直接靠近肿瘤边界的CD11C+髓样细胞中有IRF5高表达（图7D-E）。MEL1中PD1 CTL的最大浓度不是在肿瘤附近，而是在IR区域（图7F）。MHC-II+APC也很丰富，与正在进行的Treg激活一致（图7G）。成像显示IR中PD1+的CTL也表达LAG3或TIM3，mrSEQ证实了PDL1、LAG3、TIGIT和CTLA4的表达。因此，IR区域的许多T细胞似乎已耗尽。肿瘤附近终末衰竭T细胞的积聚可能反映正常的免疫稳态（免疫诱导的肿瘤消退），而不是肿瘤介导的免疫抑制（图7H）。

作者发现至少有六种免疫抑制机制在侵入前沿附近发挥作用。尤其引人注目的是PD1+CTL与PDL1+巨噬细胞和树突状细胞以及肿瘤细胞固有表型（如MHC-II和IDO1表达）结合的重叠。出乎意料的是，我们很少通过全玻片成像或高分辨率显微镜在肿瘤细胞上检测到PDL1的高表达（即使检测到IFNɣ表达）。这一发现通过25例原发性皮肤黑色素瘤的单独队列进行验证，并与转移瘤平行收集的数据进行对比，转移瘤中PDL1+肿瘤细胞很常见。作者的结论是，骨髓细胞可能是PDL1与PD1+T细胞结合的主要来源。在小鼠模型中获得的数据表明，具有重要功能的细胞类型可能是PDL1+树突状细胞，但在作者的样本中，树突状细胞和巨噬细胞在肿瘤浸润边界处的数量似乎相似。在MEL1中，CTL被发现与MIS相邻的炎症消退区域与肿瘤细胞结合。另一个邻近的完全退化区域，富含免疫细胞，但没有肿瘤细胞，表明免疫编辑正在进行且成功。然而，这些区域也具有末端耗竭CTL的优势，这表明在本文所述的数据中，成功且自我限制的抗肿瘤免疫反应的特征可能类似于侵袭性黑色素瘤中的免疫抑制。作者观察到的免疫抑制的消退和侵袭区域之间的主要差异是PDL1+髓样细胞的水平显著降低，但还需要进一步的研究来确定这是否普遍存在。

教授介绍

Peter K. Sorger教授的研究重点是控制细胞增殖和死亡的信号转导网络的系统生物学、这些网络在癌症和炎症疾病中的失调以及针对信号蛋白的治疗药物的作用机制。他的团队使用数学和实验方法来构建和测试人类和小鼠细胞信号传导的计算模型，作为理解并最终预测细胞和肿瘤对单独或联合应用药物的反应的手段。还开发了用于分析生物网络的开源软件，并参与了多项旨在提高数据重现性的合作项目。作为哈佛大学治疗科学项目（HiTS）的负责人，领导了一项大学范围内的工作，以推进用于开发新药、识别反应性患者和通过精确临床试验评估新药的基础和转化科学。

参考文献

Nirmal AJ, Maliga Z, Vallius T, et al. The spatial landscape of progressionand immunoediting in primary melanoma at single cell resolution. Cancer Discov.2022;candisc.1357.2021. doi:10.1158/2159-8290.CD-21-1357