18年发的，文章比较早了，但是是第一篇小鼠心脏非心肌细胞图谱，很多综述里都提到了这一篇，意义还是比较大的。
Highlights
- Comprehensive transcriptional profiling of non-myocyte cells in the adult mouse heart
- Detection of major cell types and characterization of transcriptional heterogeneity
- Development of tools for isolation of understudied cells, including mural cells and glia（给已有marker特异性不高的壁细胞，SMC和Schwann找了marker）
- Characterization of intercellular communication networks
- 分析了性别差异
1. scRNA-Seq Analysis of Cardiac Non-myocytes Reveals Major Cardiac Cell Types
Fig 1A：实验流程，取了雄性和雌性小鼠的心室肌，消化得到单细胞悬液。（怎么 去掉的心肌？）为了减少内皮细胞，尽可能得到更多其他细胞类型，这里做了一下分选。内皮：其他细胞=1:9
Fig 1B-C：注释得到12种细胞（成纤维分成了1和2）
⚠️⚠️⚠️
Endothelial cells: Cdh5, Pecam1
Fibroblasts: Cola1, Pdgfra, Tcf21
Granulocytes: Ccr1, Csf3r, S100a9
B: Ms4a1
T: Cd3e
NK: Klrb1c, Ncr1
Pericytes: P2ry14, Pdgfrb
Macrophages: Adgre1, Fcgr1
Dendritic cell (DC)-like cells: Cd209a
Schwann cells: Plp1, Cnp
Smooth muscle cells: Acta2, Tagln
Fig 1D：展示了每个细胞群的top10高变基因，辅助注释
作者还使用每个细胞群的高变基因做了富集分析，放在Table S1，也是辅助注释
另外：
他们每个细胞的基因均值在1897，还是用10x V2的盒子做的，这个基因数相当高了。
质控放的也很宽：<200 or >5,000 unique genes expressed, >20,000UMIs, or >25% of reads mapping to mitochondria。只滤掉了43个细胞。
2. Major Cardiac Cell Types Harbor Subpopulations that Reflect a Hierarchy of Transcriptional Diversity
对大群做了亚群细分。内皮，施万细胞和平滑肌细胞没有做细分，髓系和淋巴细胞做了细分。
Fig 2A-C：淋巴细胞的重新聚类把T细胞分出了CD4和CD8T，还分出了ILC2（Gata3, Areg, Rora）。髓系鉴定出了至少5个subtype。
这里给髓系细胞的区分困难找了理由
these hybrid expression signatures could reflect the multifaceted nature of macrophages, with cells poised to respond to a diverse range of stimuli.
Fig 2D：在髓系细胞中，鉴定出了一群同时表达髓系细胞marker和成纤维marker的细胞
作者认为这一群细胞不是双细胞或背景RNA污染的原因：
1. the population’s size is larger than would be expected based on doublet rate estimates (<5%; 10x Genomics)
2. ambient RNA contamination would likely give rise to transcriptional profiles overlapping at least one of the most abundant cardiac cell types, namely cardiomyocytes or endothelial cells
Fig 2E, F：为了验证这一群细胞的存在，作者使用了PDGFRaGFP/+小鼠，检测了心脏中GFP阳性的白细胞。并使用成像流式检测了表达巨噬marker的GFP+细胞。
Fig 2G：其他细胞中也存在成纤维基因的表达。Therefore, in line with well-established mesenchymal transition paradigms, expression of a hybrid mesenchymal phenotype is likely an inherent characteristic of a broad range of cell types.
作者在这里也提到了一些缺失细胞群：
epicardial cells：Tbx18
cardiac progenitors：Isl1
Lymphatic endothelial cells：Prox1，Pdpn （在正常心脏的非心肌中仅占了～3%）
单核细胞在这里也没有检测到，可能是数量较少，而且散在在了巨噬细胞中。
3. Novel Strategies for Isolation of Cardiac Mural Cells and Glia
壁细胞，包括周皮细胞和平滑肌细胞是脉管系统的重要组成。但是目前很难通过流式的方法鉴定出这些细胞。同样的，施万细胞已被证实存在于心脏组织中1，但是通过流式分选细胞却很难。所以这一部分就是在通过单细胞给这几类细胞找特异性marker。
Fig 3A：通常使用的marker包括Cspg4 (NG2), Pdgfrb和Mcam，特异性都不高。作者鉴定出来的Itga7, Entpd1和Cd59a等对这些细胞的区分度更好，特异性更高。
Fig 3B-F：用示踪鼠验证了PDGFRa是成纤维的marker，壁细胞表达成纤维不表达的ITGA7，ENTPD1是SMC的marker，CD59a是Schwann细胞的marker。
4. A Dense Network of Autocrine and Paracrine Signaling Underpins Cardiac Homeostasis
Fig 4A B：细胞群之间的互作分析，可以看到成纤维和其他细胞的互作是最多的。
Fig 4C：各种essential growth factors在不同细胞中的表达
Fig 4D：比如成纤维细胞和周皮细胞分别表达Csf1和Il34，通过Csf1r作用于巨噬细胞，影响巨噬细胞的growth和survival。成纤维还表达Ngf, Vegfa, Igf1和Fgf2，影响自主神经系统的神经元，内皮细胞和壁细胞。（⚠️主要依靠先验知识）
后面也是用基因鼠验证前面的结论，不禁感慨，他们好多种鼠子哦。。。
5. Widespread Cell-Type-Specific Sexual Dimorphism in Cardiac Gene Expression
因为前面送样取了雌鼠和雄鼠的心脏，这里作者比较了一下雌鼠和雄鼠心脏非心肌细胞的基因表达差异。
**Fig 5A：前面应该是混样送的，所以作者区分雌性小鼠和雄性小鼠使用的是特定基因的表达：雌性：Xist；雄性：Ddx3y, Eif2s3y, Erdr1, Gm29650, Kdm5d和Uty。
**Fig 5B：随后作者计算了M和F的差异基因，F有396个特异性上调基因，M有430个。其中超过97%的差异基因，fold change大于2，中位fold change都是1.17。
**Fig 5C：查看了差异基因的细胞类型，发现很多基因都是细胞特异性的
**Fig 5D：Furthermore, we identified 27 genes that exhibited discordant patterns of sexually dimorphic expression between cell types, revealing the dichotomous effect of biological sex on gene expression in the heart.
这部分结果提示了男性和女性的免疫反应差异
参考文献：
- Fregoso, S.P.P., and Hoover, D.B.B. (2012). Development of cardiac parasym- pathetic neurons, glial cells, and regional cholinergic innervation of the mouse heart. Neuroscience 221, 28–36.
