抗体是由免疫B细胞受到抗原刺激产生的能够特异性的和抗原结合的生物蛋白质分子。由于其能够高特异性，高亲和的结合抗原，抗体广泛应用在学术研究、疾病诊断以及医学药物各个方面。

传统抗体和纳米抗体的区别:

传统抗体分子(IgG)是一种结构相当保守的由两条相同的重链和两条相同的轻链组成的蛋白分子。抗体的轻链包含1个VL区和1个CL区，而重链则拥有1个VH区和3个CH区(CH1、CH2和CH3)。

VH区和VL区共同组成传统抗体识别抗原的最小单位，抗体可变区的序列差异决定了抗体能够特异地识别不同的抗原。而CL区和CH区则相对保守，被称为抗体的恒定区，其中CH区的CH2和CH3两个区域对于抗体招募免疫细胞发挥ADCC和CDC功能有着重要的作用。

重链抗体为驼类和软骨鱼类中天然存在的除传统抗体之外的仅由两条重链组成的特殊抗体，只包含一个重链可变区（VHH, Variable Domain of Heavy Chain Antibody）和两个常规的CH2与CH3区，CH1区缺失。重链抗体通过重链上的一个可变区（VHH）结合抗原，该可变区可以单独稳定地在体外存在，被称为驼类单域抗体(SdAb)或者纳米抗体（nanobody）。纳米抗体晶体宽为2.5nm，长4nm，分子量仅为传统完整抗体的1/10（约15kD）但依然具有完整的抗原识别能力，一般通过噬菌体筛选得到VHH序列。

得益于纳米抗体微小的结构、完整的抗原识别能力以及噬菌体筛选技术，可以获得VHH完整序列，纳米抗体可以通过体外重组表达进行大量生产，有效避免传统抗体的批次间差异问题。

纳米抗体相对传统抗体的优势：

和传统抗体相比，纳米抗体分子量小，结构简单。而得益于分子量小的优势，纳米抗体更进一步具有多个特征，使得纳米抗体在新药物发现方面表现出巨大的潜力：

（1）和靶点结合特异性更强，可以结合传统抗体结合不到的的位点；

（2）更高的组织穿透力；

（3）更高的稳定性如耐高温；

（4）适合工业化大规模生产；

（5）更容易改造和优化；

（6）更容易人源化

由于纳米抗体的这些特征，越来越多的研究机构和药物生产企业在不同的场景中关注、尝试使用纳米抗体。而纳米抗体的开发不同于传统单克隆抗体通过杂交瘤制备的方法，它一般通过免疫羊驼、构建噬菌体文库和通过噬菌体展示来筛选出候选纳米抗体，再通过纳米抗体表达和纯化后进行与抗原是否结合的验证实验。下面，我们将详细讲述推荐的实验方法制备纳米抗体的流程以及其中的关键点和操作技巧，其中的每一个步骤均由深圳康体生命经过多次优化和总结，供有需要和想尝试纳米抗体的机构参考。

免疫羊驼筛选单域抗体：

单域抗体的获得现在普遍通过免疫羊驼并通过羊驼体内免疫系统自身的抗体成熟后，分离B淋巴细胞，提取RNA，反转录获取cDNA，以cDNA为底物PCR扩增获取多样化纳米抗体基因片段，然后将多样化纳米抗体基因片段连接到噬菌粒上，构建噬菌体库。然后通过噬菌体展示筛选技术从羊驼抗体库中筛选得到最适合的抗体并对纳米抗体进行验证。整个流程主要包括羊驼免疫、噬菌体文库构建、抗体筛选、表达纯化及验证等阶段。

羊驼免疫的推荐流程：

1.准备抗原：一只羊驼可以同时免疫1-3个抗原，每次免疫总的抗原量保持在1-2mg之间，体积在2mL以下，免疫前将抗原和佐剂1：1乳化使其形成均匀混合物，4°保存。

2.免疫羊驼：记录空白羊驼耳号后开始免疫实验。每次在羊驼颈部淋巴结附近分左右两侧注射，每侧分2点注射，每点注射约0.4mL乳化好的抗原。免疫后观察半小时确认羊驼状态良好，无不适症状。每2周免疫一次，至少进行4次免疫。

3.采血：在第4次免疫后间隔5-7天从羊驼颈部静脉进行采血50ml。

4.血清分离：每次抗原免疫前进行采血用于免疫评价，每次取5mL血液；血液当天使用预冷25℃离心机，400 xg离心30分钟，分离保存上层血清，用于后续抗体效价检测。

5.分离淋巴细胞：在50mL的离心管中先加入15mL细胞分离液，然后缓慢加入15mL血液。加入血液时小心缓慢以防止血液和分离液混匀。之后离心机预冷至25℃，400 xg离心30分钟后，观察离心管中血液分离情况，上层血清保存在新的离心管中，-80度保存，用移液器小心吸取出中间棉状上层免疫细胞至新的50ml离心管中。每管加入室温放置的10mL PBS缓冲液，25℃，400 xg离心20分钟。去除上清液，每管加入室温放置的5mL PBS缓冲液，轻轻混匀后，使用血球计数板计算细胞数目，然后25℃，400 xg离心20分钟。去除上清液，根据细胞数目使用RNAiso Plus溶解分离得到的淋巴细胞得到107/mL细胞溶解液，-80℃保存。

免疫技巧：

1.羊驼的选择和免疫的抗原是免疫成功的关键。选择健康强壮、精神状态良好、体型适中的未免羊驼即空白羊驼。免疫抗原的纯度以及其正确构象对免疫羊驼后筛选到合适的抗体以致后续应用至关重要，蛋白抗原纯度一般至少不低于90%。

2.淋巴细胞的分离：及时的细胞分离可以有效阻止血液采集后的溶血以达到最好的分离效果。

3.免疫周期的选择可影响免疫效果，根据经验，1-2周免疫间隔可以使羊驼对大部分抗原有良好的免疫反应。构建噬菌体推荐流程：1.RNA提取：将用Trizol保存的外周血淋巴细胞冰上溶解后转移至1.5mL的离心管，加入1/5体积的氯仿震荡混匀；室温静置5分钟后4℃，12000g离心15分钟；将离心后的上清液转移到新的离心管；往新离心管中加入等体积的异丙醇；室温静置10分钟后4℃12000g离心10分钟；用75%乙醇清洗沉淀，4℃7500g离心5分钟后弃去上清，沉淀室温晾干后溶解于适量的无RNA酶的水中。

2.反转录cDNA：按照反转录试剂盒说明书将上一步得到的RNA一分为二反转录成cDNA，反转录引物分别用Oligo T及random primers。

3.扩增抗体片段：从反转录的cDNA中扩增特定的抗体片段，使用Taq DNA Polymerase Hot Start酶进行PCR扩增。PCR反应体系为：cDNA模板 2ul，Alpa001F引物2ul，Alpa001R引物2ul，10xTaq Buffer 5ul，dNTP 4ul， Taq（HS） 0.25ul，ddH2O补足到50ul。PCR的反应条件为：98℃3分钟；95℃30秒，57℃30秒，72℃40秒，每个循环增加2秒，重复22个循环；72℃5分钟。将得到的PCR扩增产物跑琼1%脂糖凝胶电泳，可以看到一条1.0kb左右一条0.7kb左右的PCR条带，对0.7kb大小的条带切胶使用天根DNA纯化回收试剂盒按说明书进行回收。以上一步PCR扩增并回收后的DNA片段作为底物再次扩增特定的抗体片段，使用Taq DNA Polymerase Hot Start Version酶进行PCR扩增。PCR反应体系为：DNA模板 2ul，Alpa002F引物2ul，Alpa002R引物2ul，10xTaq Buffer 5ul， dNTP 4ul， Taq（HS） 0.25ul， ddH2O补足到50ul。PCR的反应条件为：98℃3分钟；95℃50秒，55℃30秒，72℃40秒，重复12个循环；72℃10分钟。将得到的PCR扩增产物使用DNA纯化回收试剂盒按说明书回收。

4.克隆至噬菌体质粒：将上一步扩增得到的多样化抗体基因序列和噬菌体载体进行酶切，各自纯化并进行链接反应。将连接产物使用DNA纯化回收试剂盒按说明书回收，并使用超纯水溶解。

5.转化TG1：将电转杯置于冰上预冷，待TG1感受态细胞100ul融化后加入100ng回收后的连接产物，将混合后的感受态细胞和连接产物转移到预冷好的电转杯中，使用电转仪预设的Bacteria转化程序电击转化，电转后立即往电转杯中加入1mL SOC培养基，至少进行20个电转，将细胞37℃复苏60分钟后涂在含有氨苄抗性的LB培养板上过夜生长。将上一步过夜生长后的培养板上的细胞用2xYT培养基和涂布棒冲洗刮下，加入20%的甘油后保存在-80℃。

6.扩增和纯化噬菌体文库：将上一步刮下的菌体混匀后将数目约为10^9个细菌转移到100mL预先加入氨苄抗生素的2xYT培养液中，37℃220rpm培养直至OD600nm达到0.5。按照辅助噬菌体：细菌细胞数目为20:1的比例加入辅助噬菌体后继续37℃培养30分钟。加入终浓度为50ug/ml的卡那霉素，30℃过夜摇床培养。将过夜培养的细菌4℃13000rpm离心5分钟，将上清转移到新的离心管后加入1/4体积预冷的 5xPEG8000/NaCl，在冰上孵育30分钟。4℃13000rpm离心10分钟去除上清后加入1mL PBS缓冲液溶解沉淀。再次加入250ul 5X PEG8000/NaCl 后冰上孵育10分钟，4℃16000g离心15分钟后去除上清并将沉淀溶解在1mL PBS中得到噬菌体库。

构建噬菌体库技巧：

1.噬菌体文库的库容量和多样性是衡量文库质量的重要标准之一，容量越大、多样性越好的库是成功筛选出纳米抗体的有效保证；

2.影响文库容量和多样性的关键点包括：提取RNA过程中RNA的降解、反转录过程中的模板和引物、扩增过程中引物的选择和模板的用量以及PCR扩增轮数、感受态细菌的转化效率、连接体系的大小等因素；

抗体筛选鉴定推荐流程：

1.包被免疫管：将50ug 抗原加入到2mL PBS中并加入到免疫管中，4℃过夜孵育。

2.封闭：将适量扩增和纯化的噬菌体加入到1mL 3% BSA中，室温旋转孵育2h。同时往包被好的免疫管中加入2-3mL 3% BSA，室温旋转孵育2h。

3.抗原和噬菌体孵育：将封闭后的免疫管用含有0.01%吐温的PBS洗3次，每次5分钟。将封闭后的噬菌体文库加入到封闭后的免疫管中，添加PBS直至2-3mL，室温旋转孵育1h。

4.清洗：将抗原和噬菌体孵育后的免疫管用含有0.1%吐温的PBS洗20次，每次5分钟。

5.洗脱：往免疫管中加入1mL 100mM Trimethymime，室温孵育10分钟，加入1M Tris-HCl中和Trimethymime，将最后1.5mL的洗脱噬菌体转移到新的离心管中。将洗脱的噬菌体按照扩增和纯化噬菌体文库，扩增后再重复筛选过程2次，逐次减半包被免疫管的抗原量，得到3次筛选后的洗脱噬菌体。洗脱的噬菌体可进行NGS测序，得到与抗原结合的候选纳米抗体DNA序列库。

6.ELISA鉴定：同时，将上一步筛选得到的噬菌体梯度稀释后，各取100ul加入到OD600nm为0.5的TG1菌液中，37℃培养30分钟后涂布含有氨苄霉素的2xYT培养板上，37℃过夜培养第二天得到单克隆菌落。随机挑选至少192个单菌落到含有氨苄霉素的2xYT培养液的96孔细胞培养板上，37℃过夜培养后作为种子菌板，重新将菌液2ul加入新的96孔板（每孔含200ul2xYT新鲜培养液，100ug/ml 氨苄）5小时后往培养孔中各加入辅助噬菌体，37℃静置30分钟后加入终浓度为50ug/ml的卡纳霉素，30℃过夜培养。第二天将过夜培养后的菌液离心，获得含噬菌体的上清液。将过夜包被抗原孔及BSA包被对照孔用3%BSA封闭后加入上一步获得的噬菌体上清液，室温孵育1h。用含有0.1%吐温的PBS清洗3次后，加入噬菌体抗体孵育后，用TMB显色后在波长450nm读取每孔的吸光值。选取抗原包被孔与相应对照孔吸光值比例大的菌落送去测序（独立两次phage-Elisa分析），得到纳米抗体的基因序列。

抗体筛选技巧：

1. 合适量的抗原包被和抗原的分子量大小、疏水亲水性质、结构有关，也和包被缓冲液和包被介质的选择有关，合理的包被是成功筛选的基础，如果有必要可以进行预实验确定包被的条件或者可选择抗原结合磁珠的方法进行筛选。

2.洗脱后测定噬菌体的效价，经过2-4轮抗原包被淘选后，噬菌体的富集程度需要在合理范围之内。

纳米抗体表达纯化推荐流程：

Phage-Elisa筛选出的单克隆菌株进行纳米抗体片段DNA测序后即可进行表达纯化及验证。纳米抗体可在大肠杆菌，酵母或哺乳动物细胞系里进行表达，因其仅含100多个氨基酸残基，为验证其是否与抗原结合，可构建质粒在大肠杆菌中或酵母菌株中进行快速表达及纯化，或者同时在两种菌株中进行表达纯化。

大肠杆菌中纳米抗体的诱导表达及纯化：质粒构建序列确认后及转化进表达菌株如BL21，挑取单菌落进行摇瓶培养后IPTG诱导表达（胞内或周质），菌体破碎后将上清液中可溶蛋白进行纯化包括亲和层析，离子交换层析及分子筛层析。

毕赤酵母中纳米抗体的表达及纯化：质粒构建序列确认后及酶切线性化后将线性化质粒电转进酵母如GS115菌株中，平板上筛选确认单菌落后甲醇诱导表达（胞内或分泌至胞外），菌体破碎后将上清液中可溶蛋白（应用于胞内表达）或将发酵液上清中的纳米抗体（应用于分泌性表达菌株）进行纯化包括亲和层析，离子交换层析及分子筛层析。

大肠杆菌表达的优点是可迅速诱导表达，缺点是部分纳米抗体可形成包涵体，其胞内还原环境不利于纳米抗体中二硫键的形成，毕赤酵母表达的优点是可利用毕赤酵母对蛋白进行胞外分泌，从而不用进行菌体破碎，而直接从酵母发酵上清液中进行纳米抗体纯化，并且酵母很少分泌杂蛋白至胞外使得发酵上清液中的纳米抗体纯度相对较高从而易于纯化，并且胞外的氧化环境有利于纳米抗体二硫键的形成，纳米抗体中二硫键的形成对纳米抗体的稳定性至关重要。

候选纳米抗体纯化后可验证其与抗原是否结合及与抗原结合的亲和力检测:

SPR实验利用的机型为BiacoreT200，具体操作流程详见《BiacoreT200检测蛋白与蛋白结合操作指南》，检测要点如下：(1)配体偶联，首先根据以下公式计算目标偶联量：，其中，Rmax为芯片表面最大结合量，在蛋白测试中通常代入100RU。本实验选用了偶联A分子（17kD）,流过蛋白B（23kD）。Sm为化学计量比，未知时选1。RL为配体偶联水平，实验时实际偶联量为1.5倍的RL。所以经计算，RL为74RU，A分子的目标偶联量为110RU。(2)配体的预富集，A分子用醋酸钠pH5.0, 4.5, 4.0分别稀释到10 ug/ml（至少10倍稀释比），各准备100ul，通过预富集实验，确定pH5.0为最佳偶联条件。故用pH5.0的醋酸钠将10 μg/ml，200ul进行正式的偶联操作。

(3)配体偶联:

a.打开BiacoreT200 Control Software,点击File下面的Open/New wizard template，选择immobilization。对话框中，在Chiptype中选CM5，在Flowcell spercycle选1。勾选Flow cell2，method选用amine氨基偶联，ligand输入配体名称，该实验选用aimforimmobilized level，target level输入计算出的110RU。在Flow path中选择Flow path2（如芯片2通道已用，可选择4通道）。接着按Next，勾选prime，选择实验温度，一般默认25℃。b.在左侧下拉菜单中选用Sample and Reagent Rack1，系统会自动排好样品放置位置（可以通过鼠标拖拽重新安排）。根据样品架位置表，准备足够体积的样品（如果使用的是带盖的EP管，所有盖子必须剪去）。100μL的EDC放入R1D3，100μL的NHS放入R1D4，空管放入R1D5，140μL乙醇胺放入R1D6，166μl10μg/mL配体蛋白放入R1D1。盖上试管架盖子，将样品架送回样品舱。点击Next，弹出Prepare Run Protocol对话框，确认运行缓冲液体积大于表中的最低要求，点击start。

(4)样品检测过程：a.在Kinetics/Affinity界面中，将Flowpath点为2-1或4-3，Chiptype选择CM5。在Setup界面里，Startup底下的Solution一栏中填写HBS-EP，并将Numberofcycles改为3。在Kinetics/Affinity-injectionParameter界面下：在Sample一栏中Contacttime为120s，Flowrate为30μL/min，Dissociationtime为120s，再生条件为Glycine2.0，再生时间30s。

b.Kinetics/Affinity-Sample界面中，填写分析物信息：Sampleid填写样品名称，MW（Da）填写分子量，第一个Concentration为摩尔浓度将其调为μM，第二个为质量浓度，摩尔浓度填完后质量浓度会自动计算（每个样品请选择一个浓度进行重复进样，样品浓度由低到高填写）。

c.在Kinetics/Affinity-SystemPreparations界面下，直接点Next进入RackPosition界面，将ReagentRack改为SampleandReagentRack1，点开Menu后选AutomaticPositioning。将Pooling一栏全部改为Yes，VialSize根据需求进行调整，1.5mLEP管请选择medium。根据样品所在位置进行样品准备和放置。B蛋白用运行缓冲液HBS-EP进行倍比稀释。点Next后，对方法进行保存，再对数据路径进行保存，仪器便会开始自动运行。

纳米抗体的规模表达纯化：因纳米抗体为分子量约15KD左右的单链蛋白，其可由大肠杆菌或酵母中进行诱导表达并在发酵罐中规模表达，其产量均在g/L以上，故可进行量产应用于试剂盒检测，甚至临床药物规模化量产。