Science | 人工设计蛋白质纳米马达

原创 huacishu 图灵基因 2022-05-06 07:03

收录于合集#前沿生物大数据分析

撰文：huacishu

IF=47.728

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1、作者通过从头设计提供了一个自下而上的平台来探索纳米机器功能的基本原理和机制，同时补充了对自然进化产生的复杂分子机器的长期研究；

2、这些方法可以使一系列用于医学、材料科学或工业生物过程的纳米设备工程化。

美国华盛顿大学D. Baker教授课题组在国际知名期刊Science在线发表题为“Computational design of mechanically coupled axle-rotor protein assemblies”的论文。天然分子机器包含蛋白质组分，这些蛋白质组分彼此相对运动。设计具有内部自由度的纳米蛋白质结构是计算蛋白质设计的一个突出挑战。作者发现轴转子系统在体外和体内按照设计进行组装。使用冷冻电镜，作者发现这些系统填充了构象可变的相对方向，反映了耦合组件的对称性和计算设计的界面能量景观。这些具有内部自由度的机械系统是设计基因可编码纳米机器的一个步骤。

从一个机器设计蓝图开始，该蓝图由两个耦合的结构组件组成，类似于轴和转子（图1A），其中，与天然蛋白质旋转系统类似，能量景观的特征由相互作用组件的对称性、形状互补性和跨界面的特定相互作用决定。首先试图设计环状蛋白质拓扑结构或转子，其内径大小范围能够容纳轴状结合成分（图1B）。在第一种方法中，从a-螺旋串联重复蛋白开始，重新设计它们以形成C1单链结构或对称的C3或C4同源寡聚体。在第二种方法中，从螺旋重复蛋白（DHR）和螺旋束异二聚体开始，使用基于结构导向刚性螺旋融合的分层设计程序构建C3和C5循环对称转子结构。为了便于后续的显微镜表征和模块化，在转子外侧融合了另一组DHR，产生了臂状延伸（图1 A和B）。合成编码这些转子设计（12xC3s、12xC4s、2xC5s）的基因，并在大肠杆菌中表达蛋白质。对于C3_R1转子，SAXS数据分析与计算模型一致（图1B）。同样拓扑结构的另一种设计（C3_R2）也得到了类似的结果。对于C4设计C4_1，获得了与设计模型密切一致的冷冻电镜密度图（图1B）。使用负应变电镜对内径较大、拓扑结构不同（C3_R3和C5_2）的C3和C5转子进行了表征，得到了与设计模型一致的低分辨率3D重建（图1B）。

接下来，试图设计高深宽比蛋白质组件，使用三种不同的设计方法，将设计的转子蛋白质穿入其中。在第一种方法中，以参数化方式生成单螺旋主干，并在D2、D3或D4二面体对称性中使用埋入氢键网络和疏水接触优化序列，以产生具有二面体组装所需的高度特异性的自组装同源低聚物界面（图2A）。为了增加总质量并使后续电镜分析的形状多样化，将这些杆状结构的末端刚性融合到匹配对称性的环状同源低聚物上以构建哑铃状结构。在第二种方法中，通过使用片段取样构建的刚性螺旋组装成二面体结构（图2B）。在第三种方法中，由螺旋发夹式拓扑结构组成的参数化生成的同源三聚体骨架被循环排列和拉长，以生成延伸的C3同源低聚物（图2C）。获得了编码三种方法（12xC3s、12xC5s、12xC8s、6xD2s、12xD3s、6xD4s、6xD5s和12xD8s）产生的轴设计的合成基因，并在大肠杆菌中表达了蛋白质。设计的蛋白质表达良好，可溶，易于通过Ni-NTA亲和层析纯化，并在SEC上进一步纯化。第一、第二和第三种方法的成功率分别为37.5%（6/16）、43%（14/32）和33%（4/12），这是通过SEC的估计分子量（MW）与设计模型的MW之间的匹配来评估的（图2D）。

为了防止由于弱轴-转子相互作用而在低浓度下发生潜在拆卸作用，作者试图通过在转子-亚单位界面上安装二硫键，将转子固定在轴周围。为了逐步控制体外组装过程，在转子亚单位之间的不对称界面引入了埋藏的组氨酸介导的氢键网络，以实现pH控制的转子组装。为了测试这种方法，选择了上述三种机器部件——D3轴、C3转子和C5转子，并构建了具有D3-C3和D3-C5对称性的轴转子组件（分别设计为D3-C5和D3-C3）（图3A）。为了将轴和转子连接在一起，对旋转和平移自由度进行了计算采样，并设计了互补的静电相互作用表面，不包括轴上的正电荷残基（赖氨酸和精氨酸）和转子上的负电荷残基（天冬氨酸和谷氨酸）。根据设计，D3-C3可以沿主对称轴旋转和平移，而D3-C5转子具有沿x、y和z的旋转和平移组件（图3、A和B）。获得编码单轴和双转子设计的合成基因，并在大肠杆菌中分别表达蛋白质，并通过Ni-NTA亲和层析和SEC纯化。在对设计的D3轴和C3转子进行化学计量混合后，电镜分析显示了组装和分离的轴和转子分子的集合。在降低pH值并减少二硫化物后，这些颗粒呈现为开放的、线性的、难以区分的颗粒的混合物。在氧化条件下恢复pH值后，电镜显示颗粒完全组装。干涉测量分析表明，转子和轴快速关联，关联率约为103 M−1·s−1和微摩尔范围内的离解常数（Kd）。D3-C5旋转组件也获得了类似的结果，在这两种情况下，SEC和SAXS剖面与设计模型一致。

其次，试验了更直接的空间耦合，以限制构象变化，主要是转子绕轴旋转。使用形状互补的轴和转子组件，利用紧密排列的界面和氢键网络介导的特异性的能力，使限制翻译的空间结合起来。使用这种方法设计了七个轴转子组件：三个带有C3对称轴和C1转子，四个更大的设计带有C3轴和带有DHR臂延长件的转子（图4A）。根据接口指标和设计规范，每个接口设计轨迹产生不同的周期性能量景观，并形成具有整体齿轮拓扑的形状互补轴转子接口。通过双顺时针表达转子和轴对，并依靠转子组件上的单个His标签进行Ni-NTA净化，对C3-C1设计进行了装配试验筛选。12个设计中有6个是可溶性表达和共纯化的，这表明这两个组分组装在细胞中，选择了3个设计进行进一步表征。SEC曲线与天然质谱相结合表明，低聚物状态与设计的组装一致，SAXS数据也与设计模型一致。通过轴和转子的化学计量混合，对C3-C3设计（C3-C3_1至C3-C3_4）进行体外组装筛选，然后进行SEC和SAXS分析，这与预期低聚物状态的组装一致。干涉测量显示，设计的C3轴和C3转子快速组装，关联率约为103m−1·s−1和微摩尔范围内的Kd。通过增加轴和转子之间接口的表面积来设计进一步约束的轴-转子组件，以实现更广泛的能源景观图。作者设计了一个对称组件，包括一个D8轴，围绕该轴组装两个C4转子（D8-C4），包括一个C5轴和C3转子（C5-C3_1和C5-C3_2），以及一个对应于D8-C4（C8-C4）的C8-C4组件（图4A）。D8-C4组件具有一个轴，用于两个转子，测试多个耦合旋转自由度在多部件系统中的结合，还提供了一种通过实验结构表征监测转子相对位置的简单方法。C4转子具有内部C24对称性，因此对称性与D8和C8轴匹配。相比之下，C5-C3排列打破了对称性，由此产生的能量景观具有15个能量极小值，周期性反映了组成C5和C3的对称性。通过Ni-NTA纯化分离轴和转子，并进行化学计量混合，筛选12个D8-C4、12个C5-C3和6个C8-C4设计，以进行体外组装。选择了其中四种设计进行进一步的实验研究，并获得了指示轴转子复合体组装的SEC数据，而C5-C3设计的SAXS分析表明轴转子复合体组装。

对每种设计方法和对称性类别的一种结构进行了冷冻电镜检查，并将这些数据与基于设计模型的能量景观计算相关联（图3和图4）。将轴转子组件上的电子密度数据与隔离转子和轴上的数据进行比较，表明它们的刚性方向有相当大的变化。对于第一种方法生产的D3-C3和D3-C5组件，获得的2D类平均值与从设计模型和3D重建计算出的投影图非常相似，与总体设计模型拓扑和设计的异源低聚物状态非常一致（图3 C和D）。对于这两种设计，D3轴清晰可见，获得了与设计模型几乎相同的高分辨率轴结构。D3-C3轴转子组件的C1、C3和D3的三维重建在7.8 -分辨率下显示出与轴中间的转子相对应的可见密度，C3转子臂明显可见（图3C）。D3-C5设计的3D重建也显示了转子的清晰密度，但其分辨率无法进一步提高，因为相对于轴的二级结构布局似乎是可变的（图3D）。对冷冻电镜 3D重建的检查还表明，转子臂沿着旋转轴填充了多个位置（图3 C和D）。通过旋转和平移转子相对于轴产生的能量图表明，大范围的方向在能量上是可接近的（图3B），转子轴刚性方向在分子动力学（MD）模拟中波动，与D3-C3组件相比，D3-C5组件显示出更大的位移（图3B）。沿设计自由度的构象可变性的建模对于生成与实验2D类平均值非常相似的计算投影是必要的（图3、C和D）。综上所述，cryo EM数据、Rosetta模型和分子动力学模拟与轴和转子组件的约束机械耦合设计目标一致。在第二种方法生成的组件中，C3-C3组件的电镜分析得出了轴和转子清晰可见的2D级平均值（图4A）。轴的扩散密度和转子的良好分辨率密度之间的对比可能反映了构象的变化（图4 C和D）。轴转子组件主要可以对旋转自由度而非平移自由度进行采样（图4B），旋转平均增加了设计模型的预测与实验数据（图4 C和D）之间的相似性。综上所述，数据与旋转自由度沿线的可变性一致，符合设计的能量景观，该景观在60°旋转距离处有三个能量最小值（图4B）。与该景观中的深度极小值一致，获得了~5.9-Å分辨率的电镜图，该图接近设计模型（图4、C和D）。使用cryoSPARC进行的3D可变性分析计算表明，转子臂要么对齐，要么偏移，这两种状态几乎是等概率的，如乙烷的重叠和交错排列（图4 D和E）。综上所述，这些结果表明，侧链相互作用和深度能量极小的显式设计降低了纯静电相互作用观察到的构象状态的简并度，并支持能量景观和观察到的构象可变性之间的对应关系。

轴转子组件的概念验证表明，现在可以系统地设计具有内部机械约束的蛋白质纳米结构。这一进展的关键是能够计算设计具有复杂互补形状、对称性和拓扑结构的蛋白质组分。对这些形状互补的同源寡聚体成分组装成具有内部自由度的高阶异质寡聚体结构的研究，为复杂蛋白质纳米机器的设计提供了见解。首先，组件之间接口的计算造型可用于促进具有选定内部自由度的约束系统的自组装。其次，由此产生的能量景观的形状和周期性由成分的对称性、界面的形状互补性以及疏水堆积和构象混杂的静电相互作用之间的平衡决定。一般来说，轴和转子之间的界面表面积与对称的子单元数量成比例，较大的表面积提供了可用于设计的较大能量动态范围。D3-C3、D3-C5和C3-C3设计的电镜数据中明显的构象变异性和MD模拟的组合，D8-C4设计观察到的离散状态表明，这些组件填充了多种旋转状态。cryo-EM分析无法区分构象变化是否反映了旋转运动或轴转子组装期间捕获的状态，并且没有报告能量屏障高度；需要在单分子水平上的时间分辨显微镜来揭示不同状态之间的转换动力学，并将旋转能景观的计算造型与布朗动力学联系起来。作者的机械耦合轴转子系统的内部周期性但不对称的旋转能量景观提供了两个必需的元素之一。蛋白质系统可以通过基因编码在细胞内或体外进行多组分自组装。综上所述，这些方法可以使一系列用于医学、材料科学或工业生物过程的纳米设备工程化。更重要的是，从头设计提供了一个自下而上的平台，探索纳米机器功能的基本原理和机制，补充了对自然进化产生的复杂分子机器的长期研究。

教授介绍

D. Baker教授的研究集中在蛋白质结构、蛋白质折叠机制、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核苷酸相互作用和蛋白质-配体相互作用的预测和设计上。方法是通过实验来理解这些问题背后的基本原理，根据这些见解开发简单的计算模型，并通过结构预测和设计来测试模型。努力通过在计算和实验研究不断改进方法。最近的几个例子说明了D. Baker教授计算预测和设计方法的成功应用：（i）使用计算蛋白质设计方法创建了一个人工球状蛋白质，新的蛋白质可以在原子水平上精确设计，目前的工作旨在利用这些技术设计具有新功能的新蛋白质。（ii）重新设计了蛋白质-蛋白质相互作用的特异性，并证明这种特异性变化在体外和体内都适用。（iii）从头计算蛋白质结构预测。在最近的CASP4和CASP5国际蛋白质结构预测方法盲测试中，进行了前所未有的精确从头结构预测。

参考文献

Courbet A, Hansen J, Hsia Y, et al. Computational design of mechanicallycoupled axle-rotor protein assemblies. Science. 2022;376(6591):383-390.doi:10.1126/science.abm1183