应学生及个别博友的要求，尽管专业博文点击率和反应均很差，但在去San Diego参加PAG会议之前，还是抽时间给出【R高级教程】的第二专题。专题一给出了聚类分析的示例，本专题主要谈在表达谱芯片分析中如何利用Bioconductor鉴定差异表达基因。
鉴定差异表达基因是表达谱芯片分析pipeline中必须的分析步骤。差异表达基因分析是根据表型协变量（分类变量）鉴定组间差异表达，它属于监督性分类的一种。在鉴定差异表达基因以前，一般需要对表达值实施非特异性过滤（在机器学习框架下属于非监督性分类），因为适当的非特异性过滤可以提高差异表达基因的检出率、甚至是功效。R分析差异表达基因的library有很多，但目前运用最广泛的Bioconductor包是limma。
本专题示例依然来自GEO数据库中检索号为GSE11787 的Affymetrix芯片的数据，数据介绍参阅专题一。
>library(limma)
>design <- model.matrix(~ -1+factor(c(1,1,1, 2,2,2)))
这个是根据芯片试验设计，对表型协变量的水平进行design，比如本例中共有6张芯片，前3张为control对照组，后3张芯片为实验处理组，用1表示对照组，用2表示处理组。其他试验设计同理，比如2*2的因子设计试验，如果每个水平技术重复3次，那么可以表示为：design <- model.matrix(~ -1+factor(c(1,1,1, 2,2,2, 3,3,3, 4,4,4)))。接上面的程序语句继续：
>colnames(design) <- c("control", "LPS")
>fit <- lmFit(eset2, design)
>contrast.matrix <- makeContrasts(control-LPS, levels=design)
>fit <- eBayes(fit)
>fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast.matrix)
>fit2 <- eBayes(fit2)
>results<-decideTests(fit2, method="global", adjust.method="BH", p.value=0.01, lfc=1.5)
>summary(results)
>vennCounts(results)
>vennDiagram(results)
比较遗憾的是，目前limma自带的venn作图函数不能做超过3维的高维venn图，只能画出3个圆圈的venn图，即只能同时对三个coef进行venn作图。上面的venn图只有一个coef，太简单了。下面是一个由本实验室芯片数据得出的三个coef的venn图例：
>heatDiagram(results,fit2$coef)
红色为control中（与LPS相比）的高表达基因，绿色为control中（与LPS相比）的低表达基因，x轴的数字表示差异表达基因在eset2中所处的位置。
>x<-topTable(fit2, coef=1, number=10000, adjust.method="BH", sort.by="B", resort.by="M")
>write.table(x, file="limma.xls", row.names=F, sep="\t")
将结果写入limma.xls文件中，内容包括AveExpr值（比较组间绝对值的平均差异值）、logFC值（差异倍数）、t值、P值、q值（即adj.P.Val值）和B值。一般logFC值、P值、q值和AveExpr值用来作为差异表达的判断标准，比如差异倍数在2倍以上、绝对差异表达在10以上、P值小于0.01等。在Excel文件中，根据各项判断标准排序，可以很容易地得到差异表达基因列表，这个列表可以用来进行后续的分析，如GO注释、基因网络绘制等。
专题一中提到实际研究中，一般只用差异表达基因进行聚类分析，在R中，根据差异表达结果过滤表达值很简单（具体的值可以依据芯片数据的实际情况设定，比如P值可以设宽松点0.05、logFC的绝对值也可设为1或2、绝对表达差异也可设低一点，如6或8这样的值）：
>y <- x[x$P.Value < 0.01 & (x$logFC > 1.5 | x$logFC < -1.5& x$AveExpr > 10),]
>length(y$ID)
>eset3<-eset2[y$ID,]
经过上面P值、表达倍数差异和绝对差异的过滤，eset3中就只包含差异表达基因了，这样eset3可用来进行聚类分析了。
【除Bioconductor的logo，所有图片均由程序运行所得】
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