Author：ligc
Date：19/5/15
参考文章：
AKAP95 regulates splicing through scaffolding RNAs and RNA processing factors. Nat Commun 2016 Nov 8;7:13347. PMID: 27824034.
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主要内容的是利用RNA-seq及RIP-seq(RNA-immunoprecipitation)来证明AKAP95对转录后调控的 可变剪接具有重要作用。
其中对于RNA-seq分析部分主要在Methods方法的Bioinformatic analyses： - 测序平台：Illumina HiSeq 2500
- 取样物种：Homo sapiens和Mus musculus 的293个cells
- 数据类型： 双末端PE reads 2 x 50bp
- 参考基因组：人类参考基因组CRCh37/hg19
- 比对软件：TopHat(v2.0.13)
- GTF文件类型：GRCh38.70
- 比对数据质控：过滤低质量比对reads(MQ > 30)
- 平均插入长度及标准差(mean insert sizes and the s.d.'s)：Picard-tools(v 1.126)
- 计算reads count: HTSeq(v0.6.0)
- 差异基因分析：DESeq(v3.0)
- 差异外显子分析：DEXSeq(v3.1)
- (RPKM/FPKM?)The read per million normalized:BEDTools(v2.17.0), bedGraphToBigWig tool(v4)
- GO富集分析：DAVID
数据下载
第一步：在PubMeb上查找文献。
第二步：文章中method部分有数据存放在GEO数据库的GSE号，本文章为GSE81916。
第三步：GEO数据存放的FTP网址ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP075/SRP075747 可以分为以下几个部分
- 所有SRA数据的共同部分： ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant
- reads表示存放reads数据，在FTP可以看到另一个选项是analysis，表示分析结果
- ByStudy表示根据Study进行分类，其他还可以根据实验
ByExp,根据Run,ByRun. - sra/SRP/SRP075/SRP075747: 后面部分都是为了便于检索。
1.软件安装
1.1 sratookit
功能：prefetch用于下载ncbi中SRA数据库中的.sra测序原始数据；fastq-dump用于将sra数据转换为fastq格式用于后续的质控和过滤。
软件官网：sratookit;documents
安装使用：
直接从官网下载软件压缩包，不用编译即可直接使用，注意将软件的可执行程序(bin/)加入到环境变量中，即可全局使用。
批量转换时容易报错，样本量不大时可以单个样本转换
Error
for i in 'seq 59 62'
do
fastq-dump --gzip --split-3 -A /Storage/data003/ligc/AKAP95_rna_seq/raw_data/SRR35899${i}.sra
done
下载数据
推荐用aspera+prefetch下载NCBI或EBI上的sra或fastq文件
##EBI
ascp -i ~/asperaweb_id_dsa.putty era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:/vol1/fastq/SRR346/SRR346368/SRR346368.fastq.gz .
##NCBI
ascp -i ~/asperaweb_id_dsa.putty anonftp@ftp-private.ncbi.nlm.nih.gov:/sra/sra-instant/reads/ByRun/litesra/SRR/SRR096/SRR096072/SRR096072.lite.sra .
1.2 fastqc
功能：测序数据的可视化工具
软件官网:fastqc
安装使用:
conda install fastqc -c bioconda
ls *.gz | while read id; do fastqc -t 20 $id; done
##OR
ls *.gz | xargs -i echo nohup fastqc -o ../Quality_control/fastqc/ {} \& > fastqc.sh
1.3 samtools
功能：SAM Tools provide various utilities for manipulating alignments in the SAM format, including sorting, merging, indexing and generating alignments in a per-position format.
软件官网：samtools
安装：conda安装
1.4 hisat2
功能：将reads比对到参考基因组上
软件官网：hisat2
安装：conda安装
1.5 htseq
功能：将比对到基因上的reads进行计数(read count)。
软件官网：htseq
安装：conda安装
1.6 featurecounts
功能：
软件官网：http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/
安装：
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("Rsubread")
...未完待续
欢迎大家批评指正！
参考文章：
1.https://www.jianshu.com/p/b16ae34f9012
2.https://www.jianshu.com/p/9c2bf27c3921
3.https://www.plob.org/article/3013.html
