参考生信技能书
一文打通单细胞上游：从软件部署到上游分析
prefetch官网说明
cellranger官网说明
本教程是基于下载NCBI公共数据库10x单细胞数据sra文件，进行解压合并和重命名，最后运行cellranger得到单细胞表达矩阵。
第一步、下载和安装prefetch软件；
第二步、解压sra文件，如有特殊情况需要对测序文件进行合并，依据cellranger的要求对文件进行重命名；
第三步、安装和运行cellranger。
1、安装prefetch（在NCBI官网Download下载）
wget https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sdk/current/sratoolkit.current-centos_linux64.tar.gz
tar -zxvf sratoolkit.current-centos_linux64.tar.gz
echo 'export export PATH=$PATH:/lustre/home/acct-medxh/medxh/sccdata/sratoolkit.3.0.0-centos_linux64/bin' >> ~/.bash_profile
source ~/.bash_profile
prefetch -V #查看版本
2、通过prefetch下载SRA文件
首先、点击project页面All runs，下载SRR_Acc_List.txt文件
image.png
image.png
然后、通过prefetch代码下载SRA文件
#! /bin/sh
cd /lustre/home/acct-medxh/medxh/sccdata/thin.end/qingdao/
prefetch -X 100GB -O output --option-file SRR_Acc_List.txt
下载后的文件如下图
image.png
3、fasterq-dump SRA转fastq
常规的SRA转fastq文件，用的是fastq-dump软件，速度非常慢，4-5个小时才能处理完一个样本。
这里用新办法fasterq-dump，2分钟完成一个样本：
方法1：多个文件批量做
cat >fastq.sh
#! /bin/sh
ls /lustre/home/acct-medxh/medxh/sccdata/thin.end/xiamen/output/SRR*/*.sra | cut -d "/" -f 10 | while read id; do (fasterq-dump --split-files -e 24 ./$id --include-technical); done
4、同一个样本品测序文件合并（这个作者同一个样品有四个测序文件）
cat SRR17064075_1.fastq SRR17064076_1.fastq SRR17064087_1.fastq SRR17064088_1.fastq > V-LPP_S1_L001_R1_001.fastq
cat SRR17064075_2.fastq SRR17064076_2.fastq SRR17064087_2.fastq SRR17064088_2.fastq > V-LPP_S1_L001_R2_001.fastq
5、压缩一下(如果觉得文件大可以压缩，不压缩也没有关系，cellranger也能识别)
ls *fastq | while read id; do gzip $id; done &
6、下载cellranger（https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_in）
tutorial页面中使用curl和wget下载都会出现404错误，而且版本也不是最新的。需要通过Download page输入个人信息后（如下图），获得最新cellranger版本下载链接和参考基因组
image.png
确认cellranger是否安装好
(base) [medxh@login2 qingdao]$ which cellranger
~/yard/apps/cellranger-6.0.2/cellranger
7、批量运行cellranger
#! /bin/sh
ref=/lustre/home/acct-medxh/medxh/yard/reference/refdata-gex-GRCh38-2020-A
ls /lustre/home/acct-medxh/medxh/sccdata/thin.end/qingdao/output/*.fastq | cut -d "/" -f 10 | cut -d "_" -f 1 | uniq | while read id;
do
cellranger count --id=$id \
--transcriptome=$ref \
--fastqs=/lustre/home/acct-medxh/medxh/sccdata/thin.end/qingdao/output \
--sample=$id \
--nosecondary \
--localcores=40
done
sbatch -p cpu --exclusive cellranger.sh
8、得到表达矩阵，下游在R studio中进行分析
image.png
