类固醇激素雌激素通过雌激素受体（ER）在各种基本的发育和生理过程以及许多疾病状态中起作用。 哺乳动物表达两种ER亚型，即 ERα 和 ERβ，它们表现出不同的组织特异性表达模式和生物学作用。ER主要作为核转录因子发挥作用，其被天然配体17β-雌二醇 （E2） 结合后二聚化，并作为基因表达的有效调节因子。ERα与整个基因组中的 > 10,000 个位点结合，并起以下作用：（1） 促进介导组蛋白或其他转录因子翻译后修饰的共调节因子的募集，以及 （2） 调节RNA 聚合酶Ⅱ （Pol Ⅱ） 转录机制的结合或活性，最终改变雌激素反应细胞中的转录组。

先前分析存在和不存在 E2 的稳态基因表达模式的研究未能揭示雌激素调节基因集的一致观点。特别是，表达微阵列的使用在广泛使用的 ERα 阳性 MCF-7 人乳腺癌细胞系中产生了雌激素调节基因的数量差异，范围从 100 到 1500 （Cheung & Kraus，2010, Kininis & Kraus，2008)。此外，ERα 和 Pol Ⅱ 的基因组 ChIP 分析也没有清楚地了解雌激素调节的基因集。这在一定程度上是由于难以将 ERα 结合事件分配给特定的基因调控结果。 这些分析的另一个局限性是，它们专注于雌激素信号转导对Pol Ⅱ 转录的影响，而没有考虑对Pol Ⅰ 和Pol Ⅲ 的潜在影响。

通过评估成熟 mRNA 的变化来监测雌激素依赖性基因表达的一个基本弱点是，需要更长的处理时间才能留出 mRNA 积累的时间（∼3-24 小时）。这段时间允许来自刺激前 ERα 靶基因的转录本积累，但也会导致许多不直接由 ERα 介导的次级转录效应。为了解决这些问题，使用翻译抑制剂环己酰亚胺定义雌激素信号转导的即时转录效应的初步尝试表明，只有 20%-30% 的表达变化基因是主要靶标。然而，使用环己酰亚胺推断主要雌激素靶基因是有问题的，因为：（1）环己酰亚胺不抑制非编码调节RNA对基因表达的影响，而这些基因表达正被广泛认为是许多基因调控的重要机制；（2）稳态mRNA的水平不仅取决于E2的转录调控，还取决于延伸率、pre-mRNA加工和mRNA降解率。 由于这些因素，显然需要一种新的方法来最终鉴定主要的雌激素靶基因。

在这里，我们使用了全基因组核run-on 和测序（GRO-seq）以确定雌激素信号转导对 MCF-7 细胞中整个转录组的直接影响。GRO-seq是一种直接测序方法，它以极高的分辨率提供基因组中所有参与的RNA聚合酶的位置和方向的“图谱”，从而直接对转录测量。将 GRO-seq 与基于隐马尔可夫模型 （HMM） 的生物信息学方法结合使用，我们确定了 MCF-7 细胞中由Pol Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ 转录的所有（即注释和未注释）基因组区域。此外，我们通过关注次要靶标激活前的短期刺激（即 0、10 和 40 分钟）来确定 E2 信号转导的主要转录靶点。我们独特的方法揭示了E2 调节的许多意想不到的特征，提供了迄今为止对 E2 信号转导的主要和直接影响的最全面的测量。我们的研究结果为理解其他系统中的快速信号依赖性转录提供了模型和资源。

1. 从雌激素处理的MCF-7细胞中生成GRO-Seq文库

为了研究雌激素对人类细胞转录组的直接影响，我们用 17β-雌二醇 （estradiol，E2） 进行短时（0、10、40 和 160 分钟）处理雌激素剥夺的 ERα 阳性 MCF-7 人乳腺癌细胞（图 1A）。雌激素剥夺的MCF-7细胞继续活跃生长（图S1A），细胞群在整个细胞周期中显示出正态分布（图S1B）。从经 E2 处理的 MCF-7 细胞的两个生物学重复中分离细胞核，并进行 GRO-seq 以生成代表新生 RNA 的 ∼100 bp 大小的文库，并使用 Illumina 平台对其进行测序（图 1A）。短读长与人类参考基因组（hg18、NCBI36）比对，包括常染色体、X 染色体和 rDNA 重复序列的一个完整拷贝（GenBank ID：U13369.1）。在每种处理条件下，大约有 1300 万至 1700 万个reads被唯一定位到基因组，并且每个时间点的生物学重复高度相关（平均相关系数 = 0.98）（图 S1C）。GRO-seq 包含来自所有三种 RNA 聚合酶（Pol Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ）的数据。为了验证与Pol Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ 转录的reads是否与每个单独的RNA聚合酶的活性相关，我们进行了聚合酶抑制剂组合的测定，以分离每种聚合酶的数据。正如预期的那样，通过过滤器结合测定检测到的活性与GRO-seq产物组分相当，由于在重复rDNA序列中无法有效富集，GRO-seq对Pol Ⅰ转录本的组分略有低估（图S1D）。

图1B 上部显示了LHX4 和ACBD6 基因位点的read counts 与基因组位置的代表性直方图。 该图说明了数据的主要特征，包括链特异性转录、转录起始位点（TSS）附近的发散转录以及某些基因（例如 LHX4）的稳健性 E2 依赖性诱导。这些特征在同一区域的 ChIP-seq 数据中并不明显（图 1B 底部）。

2. 将GRO-Seq Reads无偏倚地分配给特定转录本

为了确定 E2 对整个转录组（即注释和未注释、编码和非编码）的影响，我们开发了一种使用双模态 HMM 调用转录本的无偏方法。该模型将整个基因组的 read counts 作为输入信息，随后将基因组分为代表“转录”和“非转录”区域的两种状态（图1C插图）。该算法对基因组基因富集区域的输入和输出示例如图 1C 所示。图 1C 顶部显示GRO-seq数据的原始read counts，中间显示预测转录本，底部显示RefSeq注释。

为了评估该方法的稳健性，我们将预测的转录本调用与现有注释进行了比较（有关详细信息，请参阅补充信息）。 首先，我们确定我们的预测是否反映了整个转录本，而不是将每个基因分解成一系列更小的单元。 然后，我们确定我们的方法是否能够准确识别相邻但不同的基因注释之间的非转录间隔。 我们发现，90%的转录注释基因与一个转录本重叠，而82%的调用转录本与注释基因重叠，恰好有一个注释。总之，这些结果表明，我们基于 HMM 的转录调用在很大程度上概括了公共注释。在许多情况下，与现有数据库中相比，我们的转录本调用提供了有关 TSS、5′ 外显子和转录终止位点的新的或更精细的信息。使用我们的算法，我们在 E2 刺激过程中的一个或多个时间点将基因组reads分配到 22,893 个转录本中，覆盖了 ∼27% 的 MCF-7 基因组。

HMM调用的转录本使用启发式方法分为6 个不同的、不重叠的类，这些类描述了每个转录本的最佳分类，给定当前可用的注释和其他信息（图S1E和S1F）。我们定义的六类转录本如图 1D 所示，包括：（1） 注释的基因和非编码 RNA 转录本，（2） 反义（基因）转录本，（3） 发散转录本，（4） ERα 增强子转录本，它们可能对应于最近描述的增强子 RNA （Kim 等人，2010 ），（5）其他转录本落入注释区域，但与注释匹配不良，以及（6）完全未注释的基因间转录。虽然每个转录本只分配给这六个类别中的一个，但在每个类别中，可以应用多个注释，从而可以准确注释属于蛋白质编码基因内含子内的miRNA基因。我们发现，50.1% 的被调用转录本映射到先前注释的基因或非编码RNA，5.2% 映射到反义转录本，16.4% 映射到发散转录本，6.8% 映射到ERα结合增强子，12.1% 是完全未注释的基因间转录本（图1D）。

3. 广泛的 MCF-7 转录组雌激素依赖性变化

我们使用最近描述的基于模型的方法确定了 22,893 个转录本中的哪一个响应 E2 而发生变化 （Robinson 等人，2010），该方法检测超出全基因组变异水平的变化（图S2A;详见实验程序）。我们将分析重点放在每个转录本 5′ 端的 12 kb 窗口上，因为我们预计在此窗口的前 10 分钟内观察到尚未扩散到较长转录本的 3′ 端的变化。令人惊讶的是，我们意外发现MCF-7 转录组的大部分（∼26%）的转录在 E2 处理后至少在时间过程中的一个点发生改变（相对于对照/未处理条件的上调或下调）（图 2A;比较是相对于未处理的条件）。即使对于我们实验中使用的短期处理，基因组的大部分也受到调节，这强烈表明这些是ERα的直接作用。例如，在 E2 处理 10 分钟时，近 10% 的 MCF-7 细胞转录组以 0.1% 的错误发现率显著变化（图 2B）。另一个令人惊讶的发现涉及上调和下调转录本的调控动态。40 分钟的 E2 处理是调控最多转录本的时间点，上调和下调的数量大致相等，但到 160 分钟 时 ∼75% 的转录本下调（图 2B）。这些转录本表明10 或 40 分钟的调控代表了雌激素信号通路的直接转录靶标的最全面和最准确的定义。

接下来，我们更详细地研究了不同类别的信号。注释的蛋白质编码和功能性 RNA 转录本作为一个类别，以及那些可能在基因调控中起作用的未注释转录本类别（例如，发散和反义），在40分钟时具有大致相等数量的上调和下调转录本（图 2C 和 2D）。相比之下，ERα增强子转录本主要上调，而基因间转录本主要下调。总之，这些结果表明了一种协调的转录反应，其中E2 信号将转录机制从基因间区域引导到对雌激素反应更关键的区域。此外，它们对雌激素调节的基因表达给出了与使用表达微阵列获得的根本不同的观点，特别是在调节的时间、幅度和强度方面。

4. 雌激素对未注释非编码转录本的调节：发散、反义和基因间转录本

我们的GRO-seq 数据显示，大量未注释的非编码转录本（包括发散、反义和基因间转录本）受到广泛雌激素调节。尽管这些转录本的功能在很大程度上是未知的，但它们被E2 调控表明它们在雌激素依赖性转录反应中发挥作用。最近的研究首次使用人类成纤维细胞（Core 等人，2008）和小鼠胚胎干细胞（Seila 等人，2008）的高通量全基因组测序方法记录了发散转录本的产生和积累。 发散转录本在基因转录的启动子处以与主要转录本相反的方向转录，并且出现在增强子（比如eRNA）和其他转录的未注释区域。发散转录本的功能尚不清楚，但已提出它们的产生通过产生无核小体区域或负超螺旋张力来促进启动子处的开放染色质结构。 我们鉴定了 518 个与蛋白质编码基因的启动子、增强子和其他未注释的转录区域相关的不同转录本，这些转录本至少在一个时间点受 E2 调节（FDR q value < 0.001）。 我们假设 E2 调控发散转录本的产生与相应主要转录本的合成相关。为此，我们测试了 844 个主要转录本/发散转录本配对，其中发散、主要或两个转录本至少在一个时间点受到 E2 的调节。如图S2B（左）所示，发散转录的E2依赖性变化与相应主要转录本的E2依赖性变化密切相关（Pearson相关：0.744；p < 2.2×10e-16）。 这一结果与发散转录在促进相应主要转录本的 E2 依赖性转录中的作用一致。

虽然还没有得到很好的表征，但反义转录已被证明在相应正义转录本的降解以及染色质水平的基因沉默中起作用。 在注释为蛋白质编码转录本的1197个反义转录本中，我们确定了 429 个受 E2 调节的转录本（FDR q value < 0.001）（图 S2C）。与发散转录本一样，我们确定了 E2 调节的反义转录本的产生是否与相应主要转录本的合成相关。基于582个正义/反义转录对，我们发现基因转录与其反义转录本之间存在非常高的相关性（Pearson相关性：0.654；p < 2.2×10e-16）（图S2B，右）。这尤其令人惊讶，因为与发散转录本不同，反义转录本不与正义转录本共享近端启动子，尽管通过基因组looping的启动子-启动子接触可能允许协调的转录反应。如果反义转录本在正义转录本的降解中起作用，如前所述，那么它们的 E2 依赖性产生可能提供一种“内置”手段来减弱一组选定的受雌激素调控转录本的稳态水平。

我们还鉴定了 2761 个与先前基因组注释没有特定关系的转录本。其中，686 个至少在一个时间点受到 E2 的影响。有趣的是，这些 E2 调节的基因间转录物中的绝大多数被 E2 处理下调（图 2D）。这些转录本的功能尚不清楚。有些可能代表当前未注释的蛋白质编码转录本或功能性 RNA。将功能归因于这些RNA并确定它们在稳态细胞RNA库中的相对稳定性将需要额外的研究。然而，它们被E2下调表明与雌激素信号传导程序有关。 也许它们会拮抗 E2 依赖性转录反应，并且必须关闭才能实现完整的雌激素反应。或者，如前所述，它们被 E2 拮抗可能是 RNA 聚合酶被转移到雌激素信号通路的真正转录靶标的被动作用。

5. 雌激素对蛋白质编码转录本的快速、广泛、瞬时调节

许多研究使用表达微阵列检查了 E2 对蛋白质编码转录本的稳态调节。鉴于我们检测短时 E2 处理后即时转录变化的敏感性，我们查看了 GRO-seq 数据中的蛋白质编码转录本。我们专注于RefSeq数据库中的注释，因为该组是最全面的转录本集合之一，并且与表达微阵列具有广泛且有据可查的重叠。如上所述，我们在每个注释的 5′ 端的 12 kb 窗口中使用Read counts，并使用 edgeR 包确定 E2 的调控，以 0.1% 的错误发现率过滤。

使用这种方法，我们总共检测到 3098 个蛋白质编码转录本，其水平在 E2 处理时间过程中的一个或多个点相对于对照（未处理）条件发生变化。总的来说，这些转录本占 RefSeq 中注释的所有基因的 ∼15%（占 9337 个表达基因的 33%），这些基因对 E2 有反应。 这比之前使用表达微阵列在 E2 处理 1 或 3 小时检测到的基因数量要多得多。 令人惊讶的是，我们发现总共有~1000 个基因在 E2 处理仅 10 分钟后上调或下调。我们使用分层聚类来定义具有相似调控模式的四类基因，包括一类快速下调的基因和三类在三个 E2 处理时间点（10、40 或 160 分钟）具有最大转录的基因（图 3A 和 3B）。下调类是最大的，占 E2 调节的蛋白质编码转录本的 ∼50%。该类中的大多数基因迅速下调（平均10分钟），并倾向于（除少数例外）在整个时间过程中保持下调。40 分钟最大转录的上调基因是第二大类，占 E2 调节的蛋白质编码转录本的 ∼34%。尽管四个类别的诱导或抑制时间过程不同，但不同类别之间的反应幅度没有差异（图3C）。有趣的是，“10 分钟最大”和“40 分钟最大”类别中的基因平均在 E2 处理时间过程结束时恢复到基础转录水平（图 3B），突出了大多数上调基因的转录反应的快速和瞬时性质。

在大多数情况下，转录的生物学相关变化应伴随着相应 mRNA 稳态水平的类似变化。我们使用基因组和基因特异性比较来验证这一假设。首先，我们比较了使用GRO-seq数据检测到的主要转录的倍数变化，以及从已发表的 MCF-7 细胞表达微阵列数据中检测到的稳态 mRNA 水平的倍数变化（E2 处理 3 或 12 小时）。对于我们观察到的受GRO-seq调控的基因子集，我们发现最强的相关性是40或160分钟的GRO-seq时间点与3小时的微阵列时间点（图S3B和S3C）。然而，请注意，与通过表达微阵列分析相比，我们检测到的E2调控基因要更多（图S3A）。如果我们将分析限制于在微阵列分析中发生变化的基因（FDR校正q value < 0.05），我们会看到GRO-seq和微阵列数据之间的相关性更高（图3D；斯皮尔曼相关性：0.75）。该分析表明，E2的早期作用几乎都是在转录水平上介导的，并且E2不直接影响RNA的稳定性或降解率。这些结果首次表明，由GRO-seq确定的转录会传播到相应mRNA稳态水平的变化。

接下来，我们随机从四类中的每类中选择了10 到 20 个基因（总共 54 个基因），使用RT-qPCR 测量每个基因在 E2 处理的 6 小时时间过程中的相对稳态水平。一般来说，通过GRO-seq测量的转录变化反映在通过RT-qPCR测量的稳态mRNA水平的相应变化中（图3E和图S4）。在几乎所有检测中，我们观察到通过GRO-seq和RT-qPCR测量的峰倍数变化之间有∼1-3小时的延迟，该延迟反映了Pol Ⅱ 到达基因3′ 端的过程以及mRNA 达到可检测水平积累（或降解）所需的时间。 与微阵列表达数据的比较一样，这些结果表明，转录的变化被有效地转化为相应mRNA的稳态水平的变化。下调和40 分钟达到最大值的GRO-seq 类别之间对应关系最强（>80% 的检测基因显示出相应的变化），而10 分钟达到最大值和160 分钟达到最大值的类别之间对应关系较弱（∼50% 的检测基因显示相应变化）。转录和稳态 mRNA 水平之间的差异可能是由于某些新生转录本固有的不稳定性，这阻止了它们产生成熟的转录本。或者，它们可能反映出特定转录本的活跃转录后调控（例如通过miRNA；见下文）。有趣的是，我们为每个 GRO-seq 时间点鉴定了许多示例基因，其中转录的 E2 依赖性变化伴随着同源蛋白水平的相应变化，包括 10 分钟达到最大值的类别（例如KRT19、MYC 和 VDR；图 S3D 和 S3E）。

对四类基因的基因术语目录（GO）分析揭示了下调和40 分钟达到最大值类别的基因功能具有相似富集模式（表S1A和S1C），这与先前从微阵列表达分析的有差异/更加丰富。具体而言，与转录、核酸代谢、细胞表面受体和 G 蛋白偶联信号传导相关的 GO 术语有显著富集。相同的 GO 术语但不同的基因既分布在上调类别也分布在下调类别中，这一事实表明从一种细胞信号转导程序（例如血清反应）切换到另一种细胞信号转导程序（即雌激素信号转导）时候，每个途径可能都需要具有相同功能类别的基因，但使用的是每个类别中的一组不同基因。有趣的是，160 min 到达最高值的GO术语显著富集了与核糖体生物发生、翻译和蛋白质合成相关的GO术语（如下所述）（表S1 D），而10 min 到达最高值的GO术语富集非常宽泛（表S1B）。

总之，我们的结果表明，蛋白质编码基因（以及其他类别的转录本；见下文）对雌激素信号转导的转录反应是快速、广泛和短暂的。这代表了与微阵列表达研究提供的雌激素反应所不同的观点，微阵列表达研究表明，对E2处理的反应是一组不断增加的被调控基因，这其中许多可能是二级或三级效应（图S3A）。

6. Pol Ⅱ 响应E2 的动力学

由于蛋白质编码基因对雌激素信号转导的转录反应是快速且短暂的，因此我们探索了 Pol Ⅱ 在四类分组的启动子上的动力学。对于每个处理时间点，我们在每类的启动子区域进行了宏基因分析，范围从-4 kb到+4 kb（图4A）。紧邻 TSS 的peaks 表明在 E2处理前后都存在参与动态变化的 Pol Ⅱ。 下游区域reads 的减少（或增加）表明转录响应 E2 的下调（或上调）。GRO-seq的结果突出强调了以下几点：平均而言，（1）Pol Ⅱ 在上调基因的TSS上的负载会在E2处理下增加，（2）上调基因的发散转录在E2处理下增加，（3）下调主要影响基因体中的Pol Ⅱ，（4）Pol Ⅱ在TSS上的加载和发散转录主要遵循基因体内的Pol Ⅱ反应。

响应 E2 时 TSS 处 Pol Ⅱ 负载的增加表明，对于这些类别的 E2 调节基因，Pol Ⅱ 的负载速度比逃逸到基因体内的速度更快。这在 40 分钟达到最大值类别的 10 与 40 分钟时间点之间以及 160 分钟达到最大值类别的 40 和 160 分钟时间点之间尤为明显，我们看到早期时间点的 Pol Ⅱ 负载增加，随后在较晚的时间点基因体内的 Pol Ⅱ 明显增加。这种“延迟” 的加载和逃逸模式对于 160 分钟达到最大值的基因来说可能是出乎意料的，因为 Pol Ⅱ 在启动子近端区域的暂停被认为允许快速激活转录以响应细胞信号传导；或者，这种反应与最近的发现非常吻合，即在启动子近端区域暂停Pol Ⅱ 允许同步基因激活（Boettiger & Levine，2009）。

Pol Ⅱ 的动力学也可以在特定上调和下调基因的例子中清楚地观察到（图4B和4C以及图S4）。响应 E2 上调的基因，观察到 Pol Ⅱ 波的前缘在 E2 处理后进入基因体（图 4B）。相反，响应E2 下调的基因，当聚合酶从TSS中移除时，观察到Pol Ⅱ 波的滞后边缘（图4C）。我们的GRO-seq分析结果为Pol Ⅱ 响应持续信号的动力学提供了前所未有的视角。

7. 雌激素对miRNA基因转录的调控：与蛋白质编码基因的调控相似

我们的GRO-seq方法还提供了主要的microRNA 转录本转录调控的大量信息。MicroRNAs （miRNAs） 是 ∼22 nt 的非编码调节 RNA，通过抑制靶标 mRNAs 的翻译或促进降解来介导基因表达的转录后调控。miRNA 前体转录本 （pri-miRNAs） 由 Pol Ⅱ 产生，或者在某些情况下由 Pol Ⅲ 产生，作为嵌入它们的“宿主”基因的一部分，或者使用它们自己的启动子从基因间区域产生。 使用我们的 GRO-seq 数据集，我们探索了 E2 对 pri-miRNAs 基因转录的调控。我们根据miRBase Ver. 14 在我们的数据集中明确鉴定了 322 个表达的含 miRNA 的转录本。其中，119 （∼37%） 在至少一个时间点（FDR q value < 0.001）受 E2 调节。 受调控的 pri-miRNA 包括一些先前发表的雌激素受控 miRNA，包括 mir-181a、mir-181b 和 mir-21。 整体来看，图 5 A 所示热图中描绘的调控模式很像从蛋白质编码转录本中观察到的（即大约一半上调和一半下调）。 几个pri-miRNAs的转录反应示例如图5B所示。两个示例的主要转录本都比处理后的miRNA大得多。因此，与蛋白质编码基因一样，在上调（或下调）基因的转录反应过程中可以看到聚合酶波的前（或滞后）边缘。总之，这些结果表明，pri-miRNA基因的转录以与蛋白质编码基因相似的模式和相似的动力学受 E2 调控。

接下来，我们确定雌激素刺激是否涉及pri-miRNA转录本与它们最终调节的蛋白质编码基因之间的协调反应。 对于这项分析，我们推断，经历长期和相对较大的调控变化的 pri-miRNAs 亚群最有可能反映为被加工的成熟 miRNA 的变化。因此，我们专注于 119 个受调节的 pri-miRNAs 转录本中的 47 个（∼40%），这些转录本显示出超过 3 倍的上调或下调。根据 TargetScan 数据库，这 47 种稳健的、受 E2 调控的 pri-miRNAs 可能靶向 ∼2700 个 mRNAs，或 ∼12.8% 的 RefSeq 中注释的 mRNAs。

有趣的是，如图 5C 所示，在MCF-7 细胞中作为靶标 mRNAs的表达比例比预期的要大，因此 16.6% 的表达基因是这些 miRNA 的靶标。 重要的是，E2调控的基因亚群比细胞表达的基因进一步富集，18.6%的E2调控mRNAs 是E2 调控的pri-miRNAs的靶标（p = 0.03）（图5C）。 此外，当选择一组较小的miRNAs时，也发现了这种富集模式，这些miRNA受超过5倍的E2调节（p = 0.02），或者取所有miRNA转录本（p = 0.02），表明无论其倍数变化如何，我们的结果对选择的阈值是稳健的。我们没有发现任何证据表明 E2 特异性地协调 pri-miRNA 的转录调控与其潜在靶标 mRNA 的调控方向（即向上或向下），无论是通过 GRO-seq（图5 D，中）还是通过表达微阵列（图 5D，右）。事实上，我们发现了协调调节和补偿调节的证据（图5D；详见图S5）。总之，这些结果表明，对于pri-miRNA转录本和成熟miRNA靶向的mRNAs的E2调节转录，存在一个综合调控程序。

8. 雌激素信号转导对蛋白质生物合成机制的显著上调

由于我们的GO分析显示，在蛋白质生物合成中具有主要生物学功能的基因富集，因此我们探索了E2信号转导是否对蛋白质生物合成机制具有更广泛的影响。GRO-seq提供了所有三种真核聚合酶的测量； 因此，我们提取并分析了UCSC基因组浏览器中rnaGene track 中注释的45S rRNA（RNA Pol Ⅰ）和tRNA（Pol Ⅲ）的变化数据。我们的分析表明，Pol Ⅰ 和 Pol Ⅲ 转录本的转录显示出 E2 的类似调节模式：（1） 10 分钟时的初始爆发，（2） 40 分钟时略有减少，（3） 160 分钟时最大（图 6A 和 6D）。这种快速效应表明其对雌激素信号转导的转录反应是主要的，而不是次要的。

对于单个tRNA基因，变化强烈偏向于上调，>90%的tRNA基因的转录显示上调（图6B）。此外，该调控在至少一个时间点明确影响 486 个功能注释的 tRNA 基因中的 158 个（32%）。如果细胞确实在调节tRNA基因以促进翻译的增加，那么人们可能会期望所有20个氨基酸都会上调。事实上，我们发现，在 158 个上调的 tRNA 基因中，至少有一个编码 20 种氨基酸中一个的 tRNA 基因 （p = 0.0012）（图S6A）。 除了 20 种主要氨基酸外，我们还发现了编码氨基酸变体硒代半胱氨酸的 tRNA，它被认为在抗氧化活性和激素生物合成中发挥作用，也受到 E2 调控。 由于每三个字母的密码子组合在 486 个注释的 tRNA 基因中多次出现，我们还询问了 E2 是否调节了 64 种可能的密码子组合比预期的更大比例。 事实上，我们发现 64 个密码子组合中有 64% 受到 E2 的明确调控，这超出了我们陈述的 32% 的 tRNA 基因受调控的预期（p = 0.0027）。这些结果表明，在蛋白质生物合成机制中观察到的变化以稳健和协调的方式应用于氨基酸和密码子变异。

我们还对具有功能或细胞定位的蛋白质编码基因进行了更集中的分析，这些基因在蛋白质生物合成中起作用（例如，核糖体生物发生、tRNA 氨基乙酰化等；所有使用的 GO 术语参见图 S6B）。 正如我们观察到的tRNA基因，这些代表性的蛋白质编码基因强烈偏向于上调（图6C）。 如上述 GO 分析所表明，这些基因在 160 分钟达到最大值的类别中强烈富集（p = 6.7 × 10e-13），表明这些是将细胞转录组中观察到的广泛变化转化为蛋白质组的持续效应。

综上所述，这些结果表明雌激素信号转导对蛋白质生物合成机制具有有效作用，这与已知的 E2 对 MCF-7 细胞的促有丝分裂作用非常吻合。此外，他们还强调了这样一个事实，即雌激素信号转导对所有三种RNA聚合酶的转录活动具有强烈、直接和可能的直接影响，而不仅仅是Pol Ⅱ。 蛋白质生物合成机制的上调可能是雌激素信号通路为细胞准备翻译蛋白质编码转录本的一种方式，这些转录本是响应雌激素信号转导而新合成的。

9. ERα 结合位点与主要的雌激素靶基因的关系

尽管大多数 ERα 结合位点位于蛋白质编码基因启动子的远端，但在上调基因的近端启动子中也观察到 ERα 结合位点的小而显著富集（Carroll 等人，2005，Carroll 等人，2006），与ERα在介导其调节中的直接作用一致。 由于我们的GRO-seq数据反映了细胞的直接转录输出，并且由于我们较短的处理时间使我们不太可能检测到转录的继发性变化，因此我们认为我们应该观察到受GRO-seq调控的基因中有很大一部分位于ERα结合位点附近。为了验证这一假设，我们使用了现有的ERα ChIP-seq 数据 （Welboren 等，2009）以确定具有近端 ERα 结合位点（距转录起始位点 < 10 kb）的 E2 调节的 RefSeq 基因的比例。 事实上，我们发现46%的基因在较短的时间点（即 10 分钟和 40 分钟）被 E2 上调，在其转录起始位点 10 kb 内含有一个 ERα 结合位点。

有趣的是，当我们分别分析四类 RefSeq 基因（即 10、40、160 分钟达到最大值和下调的）时，我们发现这些类别之间的结合位点富集存在显著差异（图 7A）。 特别是，在40分钟达到最大值的类别中，几乎一半的基因位于ERα结合位点的10 kb范围内，这远高于一般RefSeq基因的 ∼10% 富集率（p < 2.2 × 10e-16）。10 分钟达到最大值类基因的近端 ERα 结合位点也大量富集 （33%，p = 1.2 × 10e-12)。 在160分钟后达到最大值的上调基因具有较低的富集水平，没有统计学意义（12%，p = 0.24），这表明该基因子集的很大一部分反映了次要效应。 相反，下调基因位于ERα结合位点10 kb以内的可能性略低于平均水平（8%，p = 0.01）。 这一观察结果强烈表明，E2 通过不同的机制介导上调和下调，并且立即上调的基因往往是 ERα 的直接基因组靶标。那些没有近端 ERα 结合位点的 E2 调节基因可能受 （1） 其他启动子近端结合的转录因子 或 （2） 从远端 ERα 增强子到启动子的 looping 调节。

更广泛地观察转录本类别，我们发现在 E2 处理 40 分钟时定义的集合显示出比其他时间点定义的集合更丰富的 ERα 结合位点和 EREs 的富集。有趣的是，虽然与所有 RefSeq 转录本相比，在生物信息学定义的 EREs 附近启动的转录本百分比并没有大大富集，并且在转录本类别中相对恒定（即 ∼30%–50%），但在实验定义的 ERα 结合位点附近启动的转录本百分比差异很大（图 7B）。 与所有 RefSeq 相比，我们观察到 ERα 结合位点靠近注释、反义、发散和增强子转录本的起始位点时有最大富集，这表明 E2 依赖性调控模式与蛋白质编码转录本相似（图 7B）。

接下来，我们确定了GRO-seq 分析中定义的每类转录本在近端启动子 （<1 kb） 内映射的所有 ERα 结合位点的比例（即，从 ERα 结合位点为中心的视图，而不是上面以转录本为中心的视图）。 我们发现，在MCF-7 细胞中使用我们的HMM 检测到的转录本中，有18% 的ERα结合位点位于转录本附近（图7C）。这包括使用我们的方法特异性发现在 MCF-7 细胞中表达的转录本附近 ∼5%–6% 的 ERα 结合位点（图 7C，橙色条），以及在产生转录本的基因的近端启动子中发现的另外 ∼12% 的 ERα 结合位点，这些基因目前未在公共数据库中注释（即 反义、发散和增强子转录本）。尽管这一发现仍然表明长程增强子-启动子相互作用在 ERα 的作用中起着关键作用，但它同时表明位于 TSSs 附近的 ERα 结合位点的比例增加了 3 到 4 倍。

综上所述，我们的研究结果为信号依赖性转录事件提供了新的观点，提出了关于转录反应特定方面的新问题和新思维方式。

Hah N, Danko CG, Core L, Waterfall JJ, Siepel A, Lis JT, Kraus WL. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 2011 May 13;145(4):622-34.