影响因子：8.786
关于非肿瘤生信，我们也解读过很多，主要有以下类型
1 单个疾病WGCNA+PPI分析筛选hub基因。
2 单个疾病结合免疫浸润，铁死亡，自噬等基因集，机器学习算法等。
3 两种相关疾病联合分析，包括非肿瘤结合非肿瘤，非肿瘤结合肿瘤或者非肿瘤结合泛癌分析
4 基于分型的非肿瘤生信分析
目前非肿瘤生信发文的门槛较低，有需要的朋友欢迎交流！
研究概述：
在继发性脊髓损伤（SCI）中，受损脊髓的免疫微环境在脊柱再生中起着重要作用。在免疫微环境成分中，巨噬细胞/微胶质细胞在脊髓损伤亚急性阶段起着促炎症和抗炎的双重作用。这项研究旨在识别SCI亚急性期的免疫枢纽基因和靶向治疗药物。研究结果表明在脊髓损伤的亚急性期，巨噬细胞/小胶质细胞中的B2m、Itgb5和Vav1可能是促进神经再生的关键治疗靶点。此外，低剂量地西他滨可能通过调节巨噬细胞/小胶质细胞的极化状态促进脊髓再生。
流程图：
研究结果：
一、关键调控基因的鉴定
根据RNA-seq数据集的主成分分析结果，SCI组(3 dpi和7 dpi)的22个样本特征与假手术组(图2A)有明显区别。热图和火山图表明这些样品中存在1387个DEGS，包括947个上调基因和440个下调基因(图2B，C)。
2. GSE5296和GSE47681中的22个样本均满足条件，进行WGCNA分析(图3A)。确定了与SCI显著相关的五个模块(图3C、D)，其中黄色模块最显著。模块之间关联的热图如图3e所示。黄色模块中686个基因与SCI基因重要性的相关系数为0.97(图3F)。
二、关键调控基因的综合分析
1.在韦恩图中，452个基因在DEG和黄色模块基因之间交叉（图4A）。这些调控基因主要在生物途径中富集，如淋巴细胞活化的负调控、抗原的处理和外源肽抗原的表达以及对抗原刺激的炎症反应的正调控(图4B)。
2.进一步的免疫路径富集分析表明，关键的调控基因涉及干扰素-γ，收费样受体信号通路(图4C)。通过MCODE选择了29个枢纽基因(图4A，D)。这些枢纽基因参与免疫球蛋白产生、ECM受体、内皮细胞分化的正调控(图4E)。
三、免疫细胞浸润分析
1.作者计算了样本中22个免疫细胞的含量（图5A）。每个样本中免疫细胞丰度的热图如图所示5B. 此外又分析了这些样本中免疫细胞的相关性（图五C），发现M0巨噬细胞与活化NK细胞的正相关性最强，而M1巨噬细胞与M2巨噬细胞的负相关性最强。此外，SCI组的CD8+T细胞、M2巨噬细胞和静息树突状细胞水平均高于假手术组。同时，脊髓损伤组的浆细胞、记忆性CD4+T细胞、滤泡辅助性T细胞、活化的NK细胞和M0巨噬细胞水平均低于假手术组（图5D）。
2.29个hub基因的表达矩阵热图如图6A所示。6个基因（Vav1、Itgb5、B2m、Col1a2、Col4a5、Col6a2）被确定为免疫中枢基因（图6B）。根据棒棒糖图（图6C）的结果，Itgb5与静息树突状细胞的正相关性最强，Col6a2与浆细胞的负相关性最强。
四、ScRNA-seq 分析
1.在UMAP图(图7A)上鉴定出10个细胞簇(星形胶质细胞、B细胞、内皮细胞、室管膜细胞、粒细胞、小胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞、少突胶质细胞)。功能富集分析结果表明，细胞簇的功能主要集中在淋巴细胞增殖调节、白细胞活化负性调节和免疫途径中的小胶质细胞活化等方面。(图7B)。
2.图7C，D显示了免疫枢纽基因在每个簇中的表达百分比。在这些免疫枢纽基因中，Vav1，Itgb 5，B2M是小胶质细胞/巨噬细胞的特征基因(图7E)。B2M和Itgb 5主要分布于小胶质细胞(TREM 2，C1qa，Fcrls)，Vav1主要分布于巨噬细胞(CX3CR1，CSF1R，Cst 3)。10个细胞簇间相互作用的数量和强度如图7F所示。免疫细胞中，B细胞与单核细胞、巨噬细胞与星形胶质细胞、单核细胞与内皮细胞、NK细胞与神经节细胞密切相关。小胶质细胞与内皮细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞有很强的相关性。
五、免疫中心基因的验证和药物预测
在整体RNA-seq数据集中，B2m、Itgb5和Vav1在SCI组均高表达（图8A），与7 dpi的qRT-PCR验证结果一致（图8B）。基于DSigDB数据库的结果，作者推测地西他滨（P=0.02）可能是一种结合这些免疫中枢基因的小分子化合物（图8C）。使用AutoDock软件（图8D-F）成功地预测了地西他滨与B2m、Itgb5和Vav1蛋白的可能结合位点。
六、体内功能和组织学评估
1.作者制作了T9钳形SCI模型（图9A），观察到地西他滨组在SCI后6周MEPs改善（图9B）。Basso-Beattie-Bresnahan运动测试评分在脊髓损伤后6周内也有改善，但在脊髓损伤后4周内无统计学意义(图9C)。心脏、肾脏、肝脏、肺、胃和脾脏的HE染色在6周内未显示出明显的形态学变化(图9D)。
2.与SCI+PBS组相比，亚曲他滨组Arg-1、IL-4、IL-10水平升高(P<0.0 5)(图9E)。同时，依地他滨组iNOS、TGF-α和IL-1b水平均低于对照组。在十米他滨刺激下，CD 206表现出较强的红色荧光，而iNOS则表现为弱红色荧光。这些结果都支持巨噬细胞/小胶质细胞从M1型过渡到M2型(图9F)。
研究总结：
本研究利用Bulk RNA-seq和sc RNA-seq的组合，确定了SCI后免疫细胞簇和免疫中枢基因的变化，并发现了可以调节巨噬细胞/小胶质细胞极化以改善神经功能的药物，本研究中对脊髓损伤后免疫微环境的探索和免疫中枢基因的鉴定，可能为寻找更有效治疗脊髓损伤小胶质细胞的方法提供科学的依据。
