最近在做克隆载体，入手了一款非常好用的软件SnapGene。网上教程挺多的，其中最推崇四方居士的视频教程，在优酷上可以直接观看。
这款软件用来绘制图谱，编辑序列，设计引物，重组克隆都非常方便。对于克隆，在软件的Action工具栏内除了常规的限制性酶切插入克隆 ，PCR等常规操作，还列出了5种成熟的商业化的无缝克隆供使用者选择。这5种克隆技术分别是：
Gateway Cloning（门途径克隆）
Gibson Assembly（吉布森无缝克隆）
NEBuilder HiFi DNA Assembly（NEB高保真DNA组装）
In-Fusion Cloning（In-Fusion无缝克隆）
TA or GC Cloning（TA克隆GC克隆）
<!> 本文作为观后笔记，将四方居士讲解的克隆技术的原理进行文字记录和整理，以便收藏和分享。更多内容，请大家一定去观看四方居士的视频教程！
本文将会大量引用视频的截屏，如有侵权可联系删除。
分子生物学的基础——PCR
PCR的原理
PCR是所有分子生物学实验的基础，全称为聚合酶链式反应，通过高温变性，退火和延伸反应三部曲来扩增目的DNA序列。通过引物的设计变化，扩增反应的组合，特殊酶的使用等等，基础的PCR反应可以有千万种变化。下面介绍两种在克隆构建中经常会被用到的PCR方法。
重叠延伸PCR
不论变种PCR设计得多么复杂，只要画成示意图，就能一目了然。真是一图抵千言。
如图所示，重叠延伸PCR中的“重叠”指的就是两组PCR的产物，通过引物引入一段相同的序列。这段相同的序列，使得两组PCR产物的单链能够在退火时结合，这种杂交产物在DNA聚合酶的帮助下延伸成完整的DNA双链。再通过最两端的引物对融合的长篇段DNA进行扩增。
需要注意的是，引物设计时引入的“重叠”序列是反向互补配对的。
重叠延伸PCR可以将两段DNA序列进行融合，通过这种方法可以构建融合基因，也可以用来将无法一次获得全长的DNA序列，通过分段扩增，再拼接的方法获得。此外，如果“重叠”序列也可以经过特殊设计，来引入一段插入序列，如酶切位点等。
通过PCR来制造突变
由于引物与模版不完全互补配对并不影响延伸，所以用PCR引入突变主要是在引物上“做手脚”。（但注意，引物3‘末端的碱基必须互补配对！）
在引物上添加一段序列即可获得插入突变。这时候需要注意，对于表达序列，插入碱基的数目一定要是三的倍数，否则会造成阅读框移码。在引物上替换几个碱基也可以引入突变，一般用于表达产物的氨基酸突变。此外，还需要提防改造后的引物匹配到模版中的其它位置。这里可以提前用blast预测看看。
限制性酶切和连接
限制性酶切和连接是最常见的载体构建方法。利用限制性内切酶对DNA序列和载体质粒进行酶切，暴露出相同的黏性末端或者平末端，再利用DNA连接酶（一般是T4 ligase）进行连接。
无缝克隆
由于限制性酶切和连接的方法依赖限制性内切酶的使用，构建成功与否取决于目的DNA和载体序列上是否存在合适的酶切位点以及对应的酶。因此开发出无缝克隆的技术，不依赖限制性内切酶，使得克隆更加便捷，应用范围更广。
Gateway Cloning
Gateway Cloning，翻译成门途径克隆，是由invitrogen公司研发的技术，目前经过多轮收购，属于Thermo公司。Gateway的核心是利用λ噬菌体位点同源重组。
目的基因和载体基因ccdB的序列两段带有att X序列，这个att X可以看作是同源重组的“信号序列”，分为"att B"、"att P"、"att L"、"att R"四种。其中"att B"和"att P"通过BP重组酶进行交换（BP反应）；其中"att L"和"att R"通过LR重组酶进行交换（LR反应）。
目的基因首先通过与供体质粒（Donor vector）进行BP反应，获得含有目的基因序列的克隆载体，算是“入门”。随后可以与多种目的载体进行LR反应，将目的基因置换到目的载体当中。
ccd B是一种致死性基因，载体上表达ccd B时，感受态细胞无法存活，由此来清除Gateway cloning过程中的副产物。
Gibson Assembly
吉布森无缝克隆是JCVI研究所的“吉布森”教授（Daniel G. Gibson）发明，利用DNA同源重组原理，比GAteway cloning更加简单，应用非常广泛，基本上各大公司都有相应的产品。
首先目的DNA和载体两段需要有15bp的同源序列。由于这段序列可以源自载体序列，通过PCR加到目的序列上，所以实际获得的拼接是无缝的。然后通过5‘外切酶是的目的序列和载体都暴露出单链DNA，形成类似于黏性末端的单链接头，退火使目的序列和载体互补配对，利用DNA聚合酶补齐末端缺失的碱基，再用DNA连接酶“缝合”切口，从而完成克隆。
看似用到多个酶的多步反应，通过混合酶或重组酶也可以Mix的体系，进行一步操作。
In-Fusion Cloning
In-Fusion cloning是由clontech公司开发的，其原理与Gibson cloning大体相同，主要区别也是在于使用的酶，也属于专利产品。
NEBuilder HiFi DNA Assembly
NEB公司的高保真DNA组装与Gibson cloning的原理类似，使用的就是经过改造的重组酶，为其公司的专利产品。可以用一步反应进行DNA组装。它的特色还在于反应中使用的酶的高保真性。
NEB公司自己就拥有上述三种克隆方法对应的产品，官网中有对它们自家的三款产品平行比较。仅供参考。
TA or GC Cloning
TA克隆和GC克隆是最简单，也是最“小学生”的克隆。TA克隆利用Tag酶在PCR产物3‘末端加A的特性，设计对应5‘末端加T的载体与之配对。这样PCR的产物不用经过任何处理就可以与载体进行连接，一步完成。GC克隆与之相同，是利用了另一种DNA聚合酶3’末端加G的原理，当然目前这种酶用得越来越少了，几乎是停产，所以一般没人使用了。
