一、精读文献
文献题目
Large-scale generation of megakaryocytes from human embryonic stem cells using transgene-free and stepwise defined suspension culture conditions
年份：2021
作者：北京放射医学研究所血液学与生物化学实验实验室 张博文
期刊和影响因子：Cell Prolif 5.4
文章链接：* PMID: 33615584 PMCID: PMC8016648 DOI: 10.1111/cpr.13002
结论：
- MACS 分离柱，将幼稚T细胞与抗体一起孵育。然后，T细胞/抗体混合物通过MACS分离柱，其中CD8 + T细胞将粘附在柱上，CD4 + T细胞将被洗脱。
- 通过使用聚苯乙烯CellSTACK培养室，CellSTACK培养室具有636厘米的大培养底面积2和超低附着表面，推荐用于悬浮细胞的大规模扩增。在整个过程中为MK定义了三维（3D）和球状分化模型。在我们的培养系统中，来自hESCs的诱导细胞显示出MKs的特征，以及proPLT的形成和PLT释放。
- ESC多能相关蛋白OCT4，SOX2和NANOG。中胚层标记蛋白的高表达水平，如BRACHYURY（BRA）和ROR2。[图1c]
- 2D培养通过菌落形成单位（CFU）-MK测定，我们观察到第14天出现具有高表达CD41+的菌落。免疫荧光染色结果表明，大多数分化细胞共表达CD41a和VWF，约55%MK样细胞，高表达β1-管状蛋白，这是MK能够产生PLT功能的关键特征。然而，单层分化方案导致MK产量低，约为5 MKs / hESC。
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3D悬浮培养诱导这些EB在悬浮3D状态的逐步诱导培养基中分化为中胚层祖细胞，血源性内皮细胞，造血祖细胞和MK，而无需CD34免疫系选择步骤。
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来自hESCs的MK以3D诱导的方式表达和分泌细胞因子-这些结果提供了有说服力的证据，表明许多细胞因子是由来自hESCs的MK合成和分泌的，并且从3D诱导过程中获得的MK更成熟，具有更高水平的MK特征细胞因子分泌。
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从hESCs诱导的细胞堆培养的MK产生前体和PLT，结果表明，诱导的 PLTs 强烈表达 CD42 ，并与 CD41 ， CD110 ， PF4 ， VWF 和素共表达。我们使用流式细胞术来分析这些分化的PLT的表面标志物。我们发现>80%的细胞碎片与CD41a和CD61共表达，>50%的细胞碎片与CD41a和CD42b共表达，其表型与外周血PLT相似。与血液PLTs相比，这些PLTs在纤维蛋白原上具有相似的聚集能力。凝血酶刺激后，诱导和天然PLTs均显示CD62P表达和凝块聚集增加，表明凝血酶可以诱导PLTs的活性状态。
image.png 对于造血细胞的大规模生产，自旋EB方法的操作相对耗时，效率低下且难以产生超过10^7个MK
