Prosurvival longnoncoding RNA PINCR regulates a subset of p53 targets in human colorectal cancer cells by binding to Matrin 3
一、调控通路
在细胞DNA损伤的情况下，P53促进LncRNA PINCR表达，然后PINCT招募Matrin-3与P53结合形成复合体结合到P53靶标基因的增强子区域，促进基因的表达使细胞抗死亡能力增强。
二、实验流程
作者首先通过药理抑制P53与Matrin-3活性后的基因芯片筛选P53靶标基因和LncRNA，用Matrin-3处理细胞后进行q-pcr检测几种RNA的表达筛选出本文主角PINCR。用DOXO（阿霉素：DNA损伤处理）处理P53野生型和P53删除细胞后检测PINCR的表达说明DNA损伤后PINCR受P53诱导表达；为了验证P53对PINCR的作用，作者分别进行荧光素酶实验和ChIP实验说明P53促进PINCR启动子活性。在研究PINCR的功能是，作者首先进行核质分离后检测PINCR，表明PINCR在细胞核中可能参与基因转录过程的调控，然后再进行RNA pull-down、ChIP、co-IP等分别说明PINCR与P53/Matrin-3结合、P53与Matrin-3结合、P53/Matrin-3与靶标基因的启动子和增强子结合。
三、核心FIGURE
Figure1说明的是PINCR是在细胞DNA损伤后由P53直接调控的核内LncRNA。
A、q-pcr检测经Nutlin-3诱导后的结直肠癌癌三种细胞系的P53靶标基因表达，表明PINCR表达升高；
B、q-pcr检测经DOXO（阿霉素：DNA损伤处理）处理后的P53野生型和突变型细胞的PINCR表达，表明DNA损伤后PINCR表达升高，而P53突变后的PINCR表达明显比野生型低，说明PINCR表达与P53有关。
C、ChIP-SEQ，分别用Nutlin、5-FU、RITA和CTL处理细胞后用P53抗体获取与P53结合的DNA片段，产物进行高通量测序，表明Nutlin-3可使P53结合到PINCR启动子上。
D、ChIP-qpcr，细胞经DOXO（阿霉素：DNA损伤处理）处理后用P53抗体获取与P53结合的DNA片段，然后进行Q-PCR检测，表明细胞DNA损伤后P53结合到PINCR启动子上升。
E-F、荧光素酶实验，将PINCR启动子序列连接到荧光素酶报告质粒上，与P53表达质粒共转染细胞，然后检测荧光素酶活性，表明P53促进PINCR启动子活性。
H、核质分离后分别检测细胞核和细胞质的RNA含量，表明PINCR基本在细胞核中，说明PINCR可能参与的是核内基因的转录调控。
Figure2说明的是在DNA损伤时PINCR减少使G1捕获降低即增加细胞死亡。
A、用CRISPR/Cas9在HCT116细胞中删除基因组上的PINCR基因，然后用Q-PCR检测DOXO处理后的细胞PINCR的表达，表明DOXO处理细胞后PINCR升高，而删除基因后PINCR不能表达。
B-C、采用PI染色做流式细胞术检测细胞凋亡，DOXO处理细胞后删除基因组上的PINCR基因的细胞系细胞凋亡明显比PINCR野生型的多。
D、在删除基因组上的PINCR基因的细胞中转染PINCR表达质粒后检测PINCR表达，表明PINCR在细胞中表达。
E、在删除基因组上的PINCR基因的细胞中转染PINCR表达质粒后检测细胞凋亡，表明PINCR表达使细胞凋亡减少。
F、FISH检测核孔蛋白和细胞凋亡蛋白，表明DNA损伤后，基因组上删除了PINCR的细胞细胞凋亡蛋白表达增加。
G、克隆形成观察，DOXO处理细胞后，细胞的生长减少，基因组上删除了PINCR的细胞明显比野生型细胞生长少。
Figure3说明的是DNA损伤后，PINCR调控P53靶标基因的表达。
A、DNA损伤处理后用P53处理的细胞检测靶标基因表达上升的示意图，包含PINCR依赖和非依赖基因。
B、用5-氟尿嘧啶处理PINCR野生型和删除细胞后检测细胞PINCR依赖的P53靶标基因mRNA的表达，表明5-氟尿嘧啶处理后mRNA表达增加，而PINCR删除的细胞mRNA表达升高的比野生型的低。
C、用5-氟尿嘧啶处理PINCR野生型和删除细胞后，用P53抗体获取细胞中与蛋白结合的DNA片段，然后进行q-pcr检测，表明表明5-氟尿嘧啶处理后P53结合到其靶标基因启动子上增加，而PINCR删除的细胞结合的比野生型的低。
D、用5-氟尿嘧啶处理PINCR敲低细胞后进行q-pcr检测PINCR和P53靶标基因的表达，表明PINCR敲低后基因表达降低。
E-F、PI染色的流式细胞术检测细胞凋亡，表明PINCR敲低后细胞凋亡增加。
Figure4说明的是Matrin-3与PINCR结合作为PINCR下游效应因子。
A、RNA pull-down，用生物素标记的PINCR探针获取细胞中与之结合的蛋白，然后进行多肽光谱分析，表明DOXO处理细胞后，PINCR与Matrin-3结合增加。
B-C、RNApull-down，用生物素标记的PINCR探针获取DOXO处理后细胞中与之结合的蛋白，然后进行WB检测，表明PINCR与Matrin-3结合。
D、RIP，用Matrin-3抗体获取5-氟尿嘧啶处理的细胞中与蛋白结合的RNA，然后进行q-pcr检测，表明PINCR与Matrin-3结合。
A、将Matrin-3敲低质粒转染PINCR-WT细胞中，然后进行WB检测Matrin-3的表达。
B、5-氟尿嘧啶处理Matrin-3敲低质粒转染的PINCR-WT和PINCR删除细胞，然后进行PI流式细胞术检测细胞凋亡，表明Matrin-3敲低后细胞凋亡增加。
C、5-氟尿嘧啶处理Matrin-3敲低质粒转染的PINCR-WT和PINCR删除细胞，然后q-pcr检测P53靶标基因的表达，表明Matrin-3敲低后靶标基因表达降低。
Figure5说明的是Matrin-3与P53形成复合体结合到PINCR靶标基因的增强子区域。
A、co-IP，用Matrin-3抗体获取与之结合的蛋白，然后进行WB检测，表明P53与Matrin-3结合
B、co-IP，用5-氟尿嘧啶处理细胞后细胞提取物分别用Rnase A和Dnase处理然后用Matrin-3抗体获取与蛋白结合的蛋白，表明P53与Matrin-3是直接结合的。
C、用5-氟尿嘧啶处理PINCR-WT和PINCR删除细胞后用Matrin-3抗体获取与蛋白结合的DNA片段然后进行q-pcr检测，表明5-氟尿嘧啶处理处理后Matrin-3与P53靶标基因启动子结合上升。
D、用5-氟尿嘧啶处理Matrin-3敲低细胞然后用P53抗体获取与P53结合的DNA片段进行q-pcr检测，表明Matrin-3敲低不影响P53与靶标基因启动子结合。
E、 ChIP，用5-氟尿嘧啶处理PINCR-WT和PINCR删除细胞后用Matrin-3抗体获取与蛋白结合的DNA片段，然后用q-pcr检测P53靶标基因的增强子区，表明5-氟尿嘧啶处理后Matrin-3与P53靶标基因增强子结合增加。
F、 用5-氟尿嘧啶处理PINCR-WT和PINCR删除细胞后用Matrin-3抗体获取与蛋白结合的DNA片段然后进行q-pcr检测，表明5-氟尿嘧啶处理处理后P53与靶标基因增强子结合上升。
G、用5-氟尿嘧啶处理Matrin-3敲低细胞然后用P53抗体获取与P53结合的DNA片段进行q-pcr检测，表明表明5-氟尿嘧啶处理后P53与靶标基因增强子结合增加，而Matrin-3敲低细胞P53与靶标基因增强子结合不增加。
参考文献：RituChaudhary,Berkley Gryder,Wendy S Woods,et al. Prosurvival long noncoding RNAPINCR regulates a subset of p53 targets in human colorectal cancer cells bybinding to Matrin 3[J]. eLife,2017,6:e23244
