测序文件下载：
通过NCBI中的SRA搜素物种名称，获得相应的转录组数据链接，找到自己需要的数据
文件下载：推荐迅雷
Linux系统安装软件：
conda（万能conda，安装方式自行百度）
conda install sratools
1.1 SRA转fastq：
fastq-dump --gzip -I --split-3 SRR编号
如果为双末端测序，则出现两个文件
1.2 测序数据信息统计查看（fastqc）
conda install fastqc
fastqc -t 12 -o out_path sample1_1.fq sample1_2.fq
t 为线程数，-o 为输出目录，后面为样本1，样本2的测序文件
注意：如果有接头，需要过滤，通常fastp或者Trimmomatic
1.3 质控：
conda install fastp
单末端测序：
fastp -i xxx.fastq.gz -o xxx.fastq.gz
其中i为input文件，o为output文件
双末端测序
fastp -i xxx_1.fastq.gz -I xxx_2.fastq.gz -o xxx_1clean.fastq.gz -O xxx_2clean.fastq.gz
例如： fastp -i SRR6375815.1_1.fastq.gz -I SRR6375815.1_2.fastq.gz -o SRR6375815.1_1clean.fastq.gz -O SRR6375815.1_2clean.fastq.gz
用小写-i和-o规定R1文件，用大写的-I和-O规定R2文件
1.4 比对（hisat2）
conda install hisat2
建立基因组索引：
hisat2-build xxx.dna.primary_assembly.fa /data/genome 1>hisat2-build.log 2>&1
例如： hisat2-build /gss1/home/reference/cucu.fa /gss1/home/genome 1>hisat2-build.log 2>&1
其中：
xxx.dna.primary_assembly.fa 是指我们的基因组序列
/data/genome 是指我们生成的参考基因组放置的位置和前缀
1>hisat2-build.log 2>&1 是指生成的日志文件和报错文件存入hisat2-build.log里面
单末端测序文件：
hisat2 --new-summary -p 2 -x ../data/genome -U xxx.fq.gz -S xxx.sam --rna-strandness R 1>xxx.log 2>&1
双末端测序文件：
hisat2 --new-summary -p 2 -x ../ref/genome -1 xxx.fq.gz_1 -2 xxx.fq.gz_2 -S xxx.sam --rna-strandness RF 1>xxx.log 2>&1
其中
-p 是指线程数，可以根据具体条件自己调节
-x 是指我们之前构建的参考基因组的位置和前缀
-1 是指样本的R1文件
-2 是指样本的R2文件
-S 是指输出文件的名字和格式，一般使用sam格式
–rna-strandness 是指链特异性测序，在双末端测序中使用 RF 参数
1.5 整理和排序
conda insatll samtools
samtools view -S SRR6375805.sam -b > SRR6375805.bam
samtools sort SRR6375805.bam -o SRR6375805._sorted.bam
samtools index SRR6375805._sorted.bam
比对效率：samtools flagstat -@ 8 HISAT2.bam
1.6 reads 计数
featureCounts -p -a 2.gtf -o counts.txt SRR6375805_sort.bam
gtf为参考基因组的注释文件，可以用gffread 将gff3格式进行转换，这一步消耗多的内存
