注：众筹已结束！没想好怎么释放才对得起前期支持开发的朋友们。月内有空再说吧。 -- 简而言之，本文部分内容只适合看看，无法实操。
写在前面
恍恍惚惚，一个多月就过去了。七月底，我在公号上提出，要搞点事情，通过实现一系列插件，让所有人都可以在笔记本上完成基本的 RNAseq 数据分析。九月初，这正是开学的时候，系列插件已经完成。
我依稀记得两三年前，那会或是博一博二。一次多课题组联合组会上，我大体分享了 TBtools 相关开发和功能。唯一一个问题问到的是，能不能直接从测序数据开始分析。我的回答当然简单，大多数人计算资源不足，这块 TBtools 没有覆盖。换句话说，不能（但其实，我自己很清楚，勉强实现，不可能不行）。三年后，马上也毕业滚蛋了。联合组会似乎差不多就那一场之后不久，再也没有办过？
多多少少，想法总是美好的，只有实现的过程中才明白现实有多残酷。说了这么多，其实我只是想说。如果那个问题再问一次，那么现在的答案就是能。
实现过程 - 八步走
往往，我为了实现一系列的分析，会分成多步走。比如 TBtools 的热图工具，他是一天写完，但也不是一天就写完。写之前，有 JIGplot 的各种优化，有聚类算法的实现，有Newick树的解析等等；写之后，还有大量新的思路和想法来优化。同样的情况也发生在 RNAseq 系列插件上。
整体上，覆盖了数个功能，四个插件：
- SRA 数据查询与整理：SRA XML to Table，见推文：挖掘SRA的辅助小工具（NCBI高通量测序数据收录库）https://mp.weixin.qq.com/s/FnuSUqhpyKqm_HYpu6phnw
- SRA 数据链接获取：SRA XML to Table 和 SRA Number to ENA Info. 前者已经包括了 NCBI 和 DDBJ 数据下载链接，后者主要作为补充，附加 ENA 下载链接（更为稳点）。详细见：公开可获取~没有下载不到的测序原始数据！https://mp.weixin.qq.com/s/CS04e0QRjq0B-NZUfCpUAg
- Ascp GUI Wrapper：个人实测，每天清晨通过 FTP 链接下载测序原始数据，速度可以达到 10Mb/s。但更多时候数据只有不到 300Kb/s。网络合适的情况下，可以使用 Aspera ，速度可以达到 30Mb/s。于是写了并公开释放了这个插件，详细见：插件 | 人人-点点点-光速下载 NCBI/ENA NGS原始数据 https://mp.weixin.qq.com/s/YYneVPb3V6Dq5WXiq2JYTQ
- SRAtoFastq，sra 是 NCBI 定义的二代数据存储格式，文件大小比fastq.gz下，考虑网络带宽的情况下，下载 sra 数据更方便。下载后需要进行转换，于是有了插件，详细见：SRAtoFastq | 任何人都能自主分析测序原始数据 https://mp.weixin.qq.com/s/WC6Q1wr2M4CsdVZ2XYFjRA
- FastQC，无论是NCBI SRA等数据库下载，还是公司返还的测序数据，多少还是要看下测序质量，确保质量OK 或者不要有样品降解，严重污染云云，于是有插件，详细见：插件FastQC | 点点点，人人看看测序数据质量 https://mp.weixin.qq.com/s/Sz9enr_8s9P0goxEObn4TA
- Trimmomatic，无论转换得到，或者是公司测序后返还的 Fastq.gz 数据往往是原始数据，通过 FastQC 可以判断，随后进行质量控制，如去除接头和低质量碱基，于是有插件，详细见：Trimmomatic | 点点点，测序原始数据质控，技能√get https://mp.weixin.qq.com/s/Gmazcogi2KBNkv7J4hXh9Q
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Kallisto，RNAseq 数据的基本分析和目的，就是获得基因表达量矩阵。在普通笔记本上，如 4G 内存云云，那么 Kallisto 是最好的选择，于是有插件，详细见：
Kallisto | 点点点，从 测序数据 到 基因表达量矩阵 人人都可以！ https://mp.weixin.qq.com/s/zhYjsF-LiPzPetbVh7bfcA - Trans Value Sum，Kallisto 分析结果是转录本水平的表达量或Counts矩阵，但很多人感兴趣的是基因水平的，于是，公开释放了功能，详细见：汇总 | 转录本表达矩阵 到 基因表达矩阵 https://mp.weixin.qq.com/s/JPM7ofuqZcKPZjySL7w5lA
至此，完结。
因为接下来的步骤，那么无非是：
- 差异表达分析，拿到Counts 矩阵后，可以用我齐哥的网页工具（后续写个教程贴）
- 富集分析（GUI 的，基于最常用的，直接使用 TBtools 使用手册，几年前已经个释放了）
- ... 暂时没想出其他通用的分析步骤...
写在最后
复述 / 改编一个故事。
一个富商喜爱垂钓，奋斗一生，停歇下来便以钓鱼为人生乐趣。一天，他在河边垂钓时遇到一个老渔翁，见老渔翁手法纯熟，大鱼小鱼频频上钩，故向其讨教钓鱼技巧。老渔翁教授之余问道：人生在世要享受生活，你看看我，一直在钓鱼，享受一生；而你终日满足，而今闲暇时才能来钓鱼，为何不开始就和我一样来钓鱼呢？
这是有趣的故事，既然目的就是钓鱼，为什么不一开始就来钓鱼，奋斗一生，还是来钓鱼嘛不是。
但是，只要转念一想，就会发现，虽然富商和老渔翁一样，人生乐趣是钓鱼，现在也在钓鱼。但最大的区别在于，相比于老渔翁，富商钓鱼的同时，还有很多选择，比如可以去旅游？购物？烹饪？美食？云云。而老渔翁，常常只能钓鱼。
世事皆如此，大家最大的区别常常不在于做的是什么，而是能不能选择做什么或者不做什么，更或者说，有没有得选择？
TBtools 的 RNAseq 系列插件 提供了一个选择，即使不会编程，没有时间，没有服务器，任何人一样可以分析别人公开发表的（或者自己以前获得的）测序数据，进而验证自己的科研想法。
那么又回到最早提出这个想法的时候....
最后，这一系列插件众筹结束，换句话说，已经有一部分用户在使用了，后续没啥问题了，再行查看如何释放更为合适。
今天是周一，祝大伙本周科研顺利，该 accepted 的 paper 就 accepted。
