利用原核蛋白表达体系(如 E.coli表达系统)进行外源基因表达,可以采取持续型表达(如T7 启动子)或者诱导型(如T7/LacO启动子)等方式。我们从操纵子,T7表达系统两个方面进行介绍。
操纵子
原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列,且密集排列在染色体上,共同形成一个转录单位——操纵子,也称基因表达的协同单位。E.coli的乳糖操纵子含lacZ、lacY及lacA 三个基因,分别编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、β-半乳糖苷通透酶(permease)和β-半乳糖苷乙酰基转移酶(transacetylase);还有调控基因:操纵序列O(operator)、启动序列P(promoter)。此外在乳糖操纵子附近还存在可以调控乳糖操纵子的lacI基因,它可以编码Lac 阻遏蛋白(Lac repressor)。
无乳糖条件:当培养基中没有乳糖时,Lac 阻遏物结合到操纵子中的operator上,因此RNA聚合酶就不能与启动基因结合,结构基因lacZ,Y和A的表达被抑制,不能转录出mRNA,更不能翻译成蛋白。
有乳糖条件:当培养基中有乳糖时,乳糖分子分解出的别乳糖与Lac 阻遏物结合,引起阻遏蛋白构象发生改变,导致其不能结合到operator上,使RNA聚合酶能正常转录操纵子上的结构基因lacZ,Y和A。
实验中长使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)代替乳糖分解的别乳糖作为诱导剂,IPTG 是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定。
T7表达系统
T7表达系统使用噬菌体T7强启动子进行表达,因此该系统依赖于T7 RNA聚合酶。虽然E.coli中无T7 RNA聚合酶,但一些E.coli菌株(如BL21(DE3)经过改造已携带可编码T7 RNA聚合酶的基因。BL21(DE3)含有lacl基因、受lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因以及一小部分lacZ基因。这个lac基因被插入到int基因中,从而使其失活。破坏int基因可防止在缺乏辅助噬菌体的情况下发生噬菌体切割(即,溶菌)。因此BL21(DE3)中的T7 RNA聚合酶也是受Lac操纵子控制表达的基因,需要诱导剂IPTG进行诱导表达。经过IPTG诱导表达后,T7 RNA聚合酶转录翻译,进而可以结合到目标蛋白基因T7启动子上进行目标蛋白基因的表达。
T7/LacO启动子:鉴于同时需要诱导BL21(DE3)菌种中T7 RNA polymerase和目标蛋白基因的表达,IPTG一般使用1mM。
T7启动子:仅有T7启动子,无可诱导的操纵子序列,因此仅需要诱导表达BL21(DE3)菌种中的T7 RNA polymerase,IPTG一般使用0.1-0.4mM。