参考方法：https://www.bio-protocol.org/bio101/e1010133

实验原理

利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作（BiFC）和蛋白的纯化等实验操作。

在荧光蛋白(YFP、GFP、Luciferase 等)的两个 β 片层之间的环结构上有许多特异性位点可以插入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。BiFC 技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基团而发出荧光。

实验试剂

• 500 mM MES (pH5.6)
• 100 mM MgCl₂
• 100 mM 乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)
• LB 培养基
• 50 mg/mL Kana (母液)
• 25 mg/mL Rif (母液)
• 100 mg/mL Amp (母液)

实验仪器

• 一次性注射器
• 恒温摇床
• 分光光度计
• 普通离心机
• 激光共聚焦显微镜

溶液配方

• 500 mM MES (pH 5.6)：称取9.75 g无水MES，用去离子水溶解，经NaOH调pH至5.6，定容至100 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，于4 °C保存。
• 100 mM 乙酰丁香酮：称取0.196 g乙酰丁香酮，用5 mL DMSO (二甲基亚砜) 溶解，再用去离子水定容至 10 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
• 50 mg/mL Kana (母液)：称取1 g的Kana粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
• 100 mg/mL Amp (母液)：称取2 g的Amp粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
• 25 mg/mL Rif (母液)：称取0.5 g的利福平粉末，用DMSO溶解并定容至20 mL，不需要过滤除菌，直接分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
• 100 mM MgCl₂：称取1.0165 g的氯化镁六水（BBI: A610328），用去离子水溶解并定容至50 mL，于4 °C保存。
• 100 mL浸染液：2 mL的500 mM MES + 0.15 mL 的100 mM AS + 10 mL 100 mM MgCl₂，用去离子水溶解定容至100 mL即可。
• 1 L的LB 培养基：5 g酵母提取物 + 10 g胰蛋白胨 + 10 g NaCl，相应的抗生素工作浓度为50 mg/L Kana、100 mg/L Amp和25 mg/L Rif (母液)。

实验步骤

1. 种植烟草：在14 h光照/10 h黑暗，温度25 °C，相对湿度 70%条件下培养大概4～5周。

2. 转化农杆菌：将构建好的表达质粒转化至农杆菌中（注：GV3101、EHA105、LBA4404 这三种农杆菌均有报道可以用于烟草瞬时转化，在培养农杆菌时候除了添加载体所含有的抗生素外，不同农杆菌还需要添加其它种类抗生素，比如 GV3101 和EHA105还需要添加 50 μg/ml 的利福平）。

3. 小摇菌种：挑取转化有表达质粒的农杆菌克隆（EHA105）于1 mL含有相应抗生素的LB液体培养基 中，28℃摇床200 rpm培养24 h。

4. 大摇菌种：转移1 mL培养的农杆菌菌液至20 mL含有相应抗生素的LB培养基中，该LB培养基含15 μM乙酰丁香酮（20 mL的LB中加入3 μL的100 mM AS）。在28 °C，200 rpm的条件下培养至农杆菌生长的对数期(OD600 = 0.5-0.6)。

5. 处理菌种：以室温，5,000 rpm条件离心10 min以收集菌体，用浸染液 (含10 mM MgCl₂, 10 mM MES，150 μM乙酰丁香酮，pH = 5.6)悬浮农杆菌菌体至OD600 = 1.0。室温静止2～3 h (至少 0.5 h，至多不超过3 h)。

6. 等体积混合两种含有不同质粒的菌体，用1 mL的针头在烟草叶片背面轻轻点开一个小口 (注意不要刺穿)，再用去掉针头的针管吸取菌液，从叶片伤口处注射到叶片中（如图1-2：以手指抵住叶片正面，将菌液从叶片的背面渗透进去）。用记号笔标记烟草叶片水渍状区域。

7. 注射过的植株于黑暗下放置12 h，然后于21 °C左右培养至2 d后观察烟草注射农杆菌的区域有无荧光，撕取烟草叶片标记区域 (可以不撕，直接用刀挖出靠近伤口的叶片部分即可) 用激光共聚焦显微镜进行荧光的成像 (叶片背面表皮细胞层较好观察)。

图1 农杆菌注射烟草叶片

注意事项

1. 选择健康、处于壮年的烟草叶片进行注射，幼嫩或皱缩叶片不易注射，衰老叶片的表达效率较低。叶片气孔打开的时候比较容易注射，因此最好在白天注射。
2. 农杆菌菌液浓度是需要自己摸索的一个参数，OD600 = 1.0并不一定适用于所有的基因，高浓度可能导致叶片死亡，或者影响定位结果，建议设置不同浓度梯度进行比较，在可以获得荧光信号的前提下尽量采用低浓度的菌液。
3. 不同外源基因的瞬时表达效率大不相同，这一点在单转做亚细胞定位的时候表现得特别明显，效率高者基本每次都能达到100%发光，低者可能转10 次只能表达出一两次，建议在BiFC之前先做个亚细胞定位评价一下两个基因的表达效率，以便调整两个质粒的转化条件。
4. 注射后的植株通常在2 d之后观察，但不同基因表达的时间可能在1-7天不等。

PDF链接

1. 蓝奏云：https://wwi.lanzout.com/ivTRKym8w1c
2. 坚果云链接：https://www.jianguoyun.com/p/Dfiz_YkQ89yQChjpuqYE
3. 天翼云盘：https://cloud.189.cn/web/share?code=UvYNJjuaiEru