刚刚发在Journal of Hepatology (IF: 25.083) 的文章，思路很清晰验证工作也做的非常好，是很值得学习的一篇文章。
1. Single-cell RNA-seq defines hepatic cellular composition and alterations during endotoxemia
Fig 1A：为了探究内毒素血症中肝脏的细胞构成和异质性，作者对‘二次打击’内毒素血症小鼠的肝细胞和非实质细胞进行了单细胞测序。在给予lps后，取了0h，3h和12h这三个时间点的肝脏做了bulk RNAseq，单细胞测序和流式。
这个模型是给了
Ploy(I:C)(一次打击)，7h后给了lps(二次打击)。
聚肌胞聚肌胞（PolyI:C）是一种人工合成的双链核糖核酸，是一种干扰素诱导剂，有抗病毒和免疫调节功能，是TLR3的激动剂。
Fig 1BC：三个时间点一共得到了56828个细胞，分为9个细胞群。
Fig 1D-F：分别展示了各群的比例变化和marker基因。可以看到给予LPS后，髓系的中性粒细胞、KC和巨噬细胞出现了明显增加。（⚠️变化最早也最多的还是中性粒，这么早就在肝脏中出现了哦～）
Fig 1G-H：是bulk RNAseq的数据，用CIBERSORT 反卷积的算法计算了细胞比例，相当于和单细胞的结果做了一个验证。
Fig 1I-J：流式验证细胞比例变化
为了test the generality of this finding in other models of acute infection，作者在Supplement还中用流式看了盲肠结扎的sepsis小鼠模型的肝脏细胞比例和数据库下载了sepsis病人肝脏RNAseq，反卷积看了细胞比例，结论基本和前面单细胞的结论一致。
单细胞数据得到的细胞比例+bulkRNAseq反卷积算法验证+流式验证
2. Endotoxemia induces macrophage recruitment and neutrophil accumulation in the liver
先前的文献报道巨噬细胞群orchestrate内毒素血症/sepsis的进展，所以这一部分作者对巨噬细胞进行了进一步的分析。
Fig 2A：作者对巨噬细胞进行了亚群细分，得到了3个亚群：RMs (recruited macrophage), bone marrow (BM)-derived KCs 和 yolk sac (YS)-derived KCs。
Fig 2B：细胞比例变化提示正常肝脏中94.34%都是BM和YS起源的KCs。RM则在病程中时间依赖性的增加。
Fig 2C：三类巨噬的Marker基因：
RMs：Cx3cr1, Fabp5, Ms4a7和Clec4b1
BM-derived KCs：Vsig4, Folr2和Clec4f
YS-derived KCs：Hmox1, Timd4, Ank2和Cd163
Fig 2D：WGCNA鉴定出5个基因共表达模块，模块123主要与RM相关，模块4主要与YS-derived KCs相关，模块5主要与BM-derived KCs相关。
Fig 2E：五个模块的GO富集结果提示两类derived KCs在应对细菌感染中起到重要作用。YS-derived KCs特异性的富集到response to IFN-b通路。BM-derived KCs则展示出bacterial pathogen uptake and clearance capability。时间依赖性增加的RM细胞则在分泌细胞因子、趋化因子、招募淋巴细胞和循环髓系细胞中起到重要作用。
Fig 2F：因为RM细胞特异性表达Cx3cr1，所以作者构建了CX3CR1gfp/gfp reporter鼠，一样构建了二次打击模型
Fig 2G-I：报告鼠的结果也提示RM在造模后时间依赖性增加，而且主要分布在门静脉周围。I图是中央静脉和门静脉的CX3CR1+细胞之比。
Fig 2J-N：Surprisingly，作者发现在内毒素血症早期，RMs是合成一系列PD-L1诱导因子比如IL-17 (Il17),IL-27 (Ebi3)和IL-6 (Il6)主要细胞群。
因为Fig1的结果中，中性粒细胞是变化最大的细胞群，Fig. S8对中性粒细胞也进行了一下简单分群和功能富集。一共分了三群：Neutrophil, Early NETs associated neutrophil和Late NETs associated neutrophil。都是描述性的结论，而且和文章主线不相关，所以放在supplement。
3. Endotoxemia alters T lymphocyte transcriptional profiles and suppresses T cell functions
对T细胞进行了进一步的分析
Fig 3A-D：T细胞进一步分为6个群+1个NK群，展示了比例变化和marker基因。LPS3h后，CD3+细胞, CD4+CD8+T细胞和CD8+T 细胞早期出现数量增加，12h又出现下降。NK细胞则持续出现增加。
Fig 3E：流式验证前面的比例变化结果
Fig 3F：计算了7类细胞的Suppression, Effect, Antigen presentation, Apoptosis, Proliferation评分（没有标p值呢）。可以看到各类T细胞增殖、凋亡、抗原呈递都呈时间依赖性的增加。
既往研究显示，T细胞的失代偿和抑制是严重感染时的hallmark。CD4+T细胞和Trm细胞的immunosuppressive genes在3h时显著上调，在12h则出现下调。因此作者推断 the inhibition of CD4+ T细胞和Trm细胞的inhibition是被immunosuppressive genes介导的。
❗️免疫抑制相关通路可以分为3类：细胞表面抑制性受体 (比如Pdcd1 (PD-1))，可溶性抑制性分子 (比如Il10)和免疫调节细胞 (比如Treg和其他细胞)1
Fig 3G：作者查看了上述三类分子在CD4+T细胞和Trm细胞中的表达，发现T细胞的这些抑制性分子在LPS后早期显著上调，后期又出现下降。
Fig 3H：体外通过anti-CD3, anti-CD28和IL-2 co-stimulated T cell proliferation实验，发现给了LPS的小鼠，CD4+ T细胞增殖能力显著下降。
Fig 3I：给了LPS的小鼠和con相比，CD4+ T细胞明显高表达抑制性受体比如PD-1，同时出现了功能受损，表现为效应分子IL2, IL4和TNFa表达的下调。
在被检测到的抑制性受体和他们的配体中，PD-1/PD-L1是被研究的最透彻的，and can be targeted by FDA-approved therapeutic reagents.
Fig 3J-K：作者观察到PD-L1(CD274)在lps 3h也显著增加，而且主要是在肝细胞表达。这个结果和lps 3h时PD-1在T细胞的表达和T细胞的抑制相一致。
4. Innate and adaptive B cell immunity is activated in endotoxemia and accompanied by spatial adaptation
B细胞的分析放在Supplementary Fig 5，跟主线不相关。
5. Hepatocytes play a key immunoregulatory role in endotoxemia
随后作者对肝细胞进行了分析
Fig 4A-D：肝细胞分为了3类：periportal hepatocytes (PPHs)，sinusoidal hepatocytes (SHs)和pericentral hepatocytes (PCHs)，展示了一下marker基因和比例变化。正常情况下，PPHs和PCHs占了总肝细胞的75%，SH则在病程中逐渐增多，在lps12h占到92%。
Fig 4H：富集分析的结果显示，PPHs有很强的氨基酸和脂肪酸代谢能力，糖代谢则在PCHs更活跃（和既往报道一致）。
由于PPHs和PCHs并未出现凋亡增加(Fig. S12A-D, F-G)，作者推测：LPS后PPHs和PCHs逐渐失去了它们的特征基因，丢失了功能，也不再按带状分布（gradually lose feature genes that identify their functions and zonation profiles during endotoxemia）
Fig 4F I：为了验证这个推测，作者对不显著表达periportal和pericentral基因的肝细胞进行了PCA降维（直接做的SH细胞还是重新按marker基因对细胞分了类？），结果提示肝细胞分为2类，一类功能主要与代谢相关，另一类则出现了明显促炎活性。
Fig 4G H：各个亚群的top50 DEGs也可以将PIHs从PPHs, PCHs和SHs区分开来。
Fig 4J K：为了进一步证明PIHs的来源，作者分别做了PPHs, PCHs和SHs和PIHs的pairwise comparisons，也就是计算了上调和下调的差异基因，发现PPHs和PIHs的差异基因是最少的。
Fig 4L-M：随后作者做了RNA velocity和Slingshot analysis。RNA velocity定义出5条分化path，提示PIHs可以由PPHs和PCHs分化而来，主要是由PPHs分化而来，而很少由SHs分化而来。Slingshot分析也提示了类似的结论。
为了进一步探究内毒素血症中肝细胞介导的cellular communication，作者用CellChat做了细胞互作分析。
Fig 4N：互作结果提示lps后3h，肝细胞和巨噬细胞的互作评分最高（没有区分亚群）。
Fig 4O：3类肝细胞和3类巨噬细胞互作的结果提示，PIHs和RMs的互作中，CCL趋化因子通路作用最强。而且CCL家族中，CCL2-LLR2的互作评分最高，尤其是在PIHs和RMs的互作中。
Fig 4PQ：差异分析的结果也显示Ccl2在PIHs中显著上调而Ccr2在RMs中显著上调。
这些结果提示：在内毒素血症早期，肝细胞可以转化为PIHs，并且通过CCL2-CCR2互作趋化巨噬细胞。
Fig 4R：值得注意的是，lps后3h肝细胞表达Cd274显著上调。
Fig 4S：而lps后3h在三种肝细胞中，PIHs的Cd274表达最高，其次是PPHs。肝细胞中Cd274 (encoded PD-L1) 的表达pattern与T细胞中Cd279 (encoded PD-1)的表达模式一致。这可能提示了内毒素血症中T cell suppression的新机制。
6. Validation of hepatocyte recruitment of macrophages via a CCL2-mediated pathway
为了验证Fig5的结论，作者做了体内和体外实验验证了肝细胞通过CCL2-CCR2趋化巨噬细胞。
Fig 5A-B：qPCR结果提示不管是肝脏组织还是原代肝细胞，给了lps之后Ccl2都有一个时间依赖性的显著增加，和前面的结论一致。
Fig 5C-E：使用AAV-8-shCCL2，作者成功的在肝脏组织和肝细胞中抑制了LPS诱导的Ccl2表达。Ccl2的表达下降程度超过50%。
Fig 5F：细胞迁移实验显示AAV-8-shCCL2处理肝细胞后，hepatocyte-induced BMDMs migration显著下降。
Fig 5G：抑制了肝细胞Ccl2的小鼠，在lps诱导内毒素血症后，存活率上升。
Fig 5H：Elisa结果也显示和AAV-8-NC-treated小鼠相比，给予AAV-8-shCCL2的小鼠外周血促炎因子(MCP1 (CCL2), IL1和TNFα)水平显著下降。
Fig 5I：肝细胞中Ccl2的抑制也减轻了内毒素诱导的肝细胞损伤，表现为血清转氨酶 (ALT和AST) 的下降。
Fig 5J-L：流式，HE和Tunel染色同样证实了CCL2 inhibition减轻了内毒素诱导的肝细胞凋亡。
In summary, this in vitro and in vivo evidence showed that hepatocytes recruited RMs to the liver via CCL2-mediated pathways during endotoxemia.
7. Upregulation of PD-L1 in hepatocytes induces T cell suppression during endotoxemia
前面的结果提示，内毒素血症时PIHs中的Cd274出现上调 (Fig. 4R-S)。作者进一步针对这个结论进行了验证。
Fig 6A：poly(I:C)和LPS处理后的小鼠分离出的肝脏原代细胞在BMDM缺乏的时候，Cd274的表达并没有明显上调。（BMDM换成THP-1/肝脏原代细胞换成LO2肝细胞也是一样的结论）
Fig 6B：在体内，qPCR结果提示AAV-8-shCCL2介导的巨噬细胞招募减少显著抑制了肝组织和肝细胞中Cd274的表达。(流式结果提示Cd274编码的PD-L1也降低)
前面的结果提示内毒素血症中T细胞出现明显免疫抑制，表现为一系列免疫抑制基因比如Pdcd1, Lag3, Sh2d1a, Cd160和Ctla4的上调(Fig. 3G)。
为了验证肝细胞诱导的T细胞抑制是否是通过PD-1/PD-L1轴，作者在LPS-challenged mice中使用AAV-8-shPD-L1抑制了PD-L1的表达。
Fig 6C：作者使用qPCR(和流式)检测了内毒素血症中Cd274的表达。在给予LPS后，肝细胞表达Cd274显著上调，给予AAV- 8-shPD-L1后表达则受到抑制。
Fig 6D：流式结果提示内毒素血症 (和CLP诱导的sepsis)中，肝细胞PD-L1的抑制显著增加了肝脏中CD4+和CD8+T细胞的比例。
Fig 6E：AAV-8-shPD-L1抑制肝脏Cd274的表达后，小鼠死亡率也下降。
这些结果提示内毒素血症中，肝脏中肝细胞PD- L1上调可以诱导T细胞suppression。
Fig 6F：为了在体外验证RMs通过reprogrammed hepatocytes介导T-cell suppression，作者使用了一套co-culture system。在这个系统中，CD4+T细胞被暴露在有/没有BMDM-derived condition medium和肝细胞contact的环境中。前面Fig. 2K的结果提示，内毒素血症中RMs表达Il27显著升高，作者因此也使用了IL27 p28 (又称IL30)的中和抗体 (Nab)，看是否可以减轻肝细胞和BMDMs引起的T细胞抑制。
Fig 6G I：CCK8实验显示在与LPS处理后的BMDMs的上清和肝细胞共培养时，CD4+ T细胞出现明显的活性抑制(G)。流式的结果也显示胞内增殖marker Ki67出现显著下调(I)。
Fig 6H J：而这种抑制效应可以被IL27 p28/IL30的中和抗体所阻断。
8. Zonation patterns of liver endothelial cell injury in endotoxemia
The graded lobule microenvironment gives rise to spatial division of labor among LSECs (肝窦内皮细胞)。
Fig 7A：使用此前报道的一个LEC(肝脏内皮细胞) hallmark gene panel，作者将LSECs聚为了3类：periportal ECs/PECs，pericentral ECs/CECs和sinusoidal ECs/SECs。
Fig 7B-E：细胞比例变化和marker基因展示。内毒素血症中，LSECs整体是减少的，而且PECs和CECs出现时间依赖性的减少。
Fig 7FG, HI：流式和免疫荧光验证了LSECs的减少
Fig 7J-L：GO和GSVA探究了三类EC的功能。结果提示大血管周围的LSECs存在逐渐增强的炎症和凋亡反应和抑制的代谢反应。此外，和肝细胞类似，和中央静脉区相比，门静脉区周围的LSECs展示出更强的炎症和凋亡反应。
内皮细胞的这种表现有利于fenestrations和循环免疫细胞进入组织。
In summary, our study provides the first evidence from single-cell transcriptomic analyses that phenotypic transition of hepatocytes in response to endotoxemia plays central roles in the recruitment of circulating monocytes to generate an RM population and in the inhibition of T lymphocytes. This study advances the understanding of the pathophysiology of endotoxemia from the perspective of liver, and these findings provide pivotal foundations for the development of an effective therapeutic approach for acute infection.
参考文献：
- Wherry EJ. T cell exhaustion. Nat Immunol 2011;12:492-499.
