本文发表在Autophagy ,感兴趣的可以下载https://doi.org/10.1080/15548627.2020.1714209，废话不多，直接进入正题。
本文介绍了KRAS基因突变与免疫表型相关的研究，众所周知，KRASG12D突变是胰腺癌（PDAC）最常见的突变类型，但是，在免疫表型中的作用未知，特别是在TAM表型转换上有何作用？本文就该内容进行了研究，发现氧化应激诱导癌细胞释放KrasG12D蛋白，使其发生自噬依赖性的铁死亡。细胞外的KrasG12D被包装入外切体中，然后被巨噬细胞通过AGE依赖的机制摄取。KrasG12D通过STAT3依赖的脂肪酸氧化使巨噬细胞转变为M2样促肿瘤表型。因此，破坏KrasG12D的释放和摄取可以取消巨噬细胞介导的对小鼠胰腺癌的刺激作用。重要的是，巨噬细胞中KrasG12D的表达水平与胰腺癌患者的低生存率相关。
介绍一下铁死亡，主要特征就是细胞内铁集聚和ROS增多，线粒体形态改变等一些表现。可以通过电镜、FACS、WB、rt-PCR检测。自噬依赖性铁死亡在癌细胞死亡过程中KrasG12D的胞外释放，作者使用了两个都含有KrasG12D突变的人PDAC细胞系(PANC1和AsPC1)。过氧化氢(H2O2)以时间依赖的方式诱导PANC1和AsPC1细胞以及原代人PDAC细胞(我们将称为“pHsPDAC”)释放KrasG12D。
那么，氧化应激导致细胞死亡众所周知，在癌症中也存在，肿瘤是哪种方式死亡的呢？作者进一步又应用了自噬抑制剂（氯喹）、凋亡抑制剂（Z-V AD-FMK）和坏死抑制剂（坏死磺酰胺）加入到过氧化氢处理的胰腺癌中，发现了氯喹具有抑制细胞死亡的作用，说明自噬在肿瘤氧化应激死亡中的作用，通过敲除自噬相关基因（ATG5/7）,限制了H2O2诱导的细胞死亡(图1F)和PANC1和AsPC1细胞释放KrasG12D。到此为止没有铁死亡什么事啊！作者不知为何非要把铁死亡拉进来，又进一步说明了铁死亡在肿瘤死亡中的作用，巴拉巴拉，然后用铁死亡的抑制剂铁抑素-1和黄芩素能够抑制过氧化氢诱导的细胞死亡和KRASG12D的释放。铁死亡诱导剂erastin和RSL3导致自噬标记物MAP1LC3B(微管相关蛋白1轻链3β)的斑点的形成和细胞KrasG12D释放。所有这些效应都被shRNA敲除ATG5所逆转。为什么铁死亡会让KRAS释放升高？？纯属自娱自乐哈。
讲了这么多，也只是介绍了自噬、铁死亡，本文重点是TAM的表型modify，别急，马上来。KRAS蛋白是怎么从肿瘤传递到TAM的。这里不得不说一个最近国自然最火热的领域之一——外泌体，这也是我的研究领域哈。具体分离、提纯、鉴定方法我就省了。介绍一下什么是外泌体吧，以前以为是细胞的“废物”，但是最近发现其在肿瘤中的作用非常大，是肿瘤与周围环境进行沟通的媒介，大小为100nm左右，双层磷脂膜结构，其内容为非编码RAN 、蛋白、脂质等。做外泌体功能验证首先要证明这个外泌体能够进入靶细胞中，并且在靶细胞中发挥作用。外泌体功能研究当然缺少不了抑制外泌体释放的药物GW4869,可以用作loss of function验证。也有研究应用敲除外泌体释放关键蛋白RAB27来抑制释放，其中效果也是一样的。
文章脑洞也是新奇，又叙述了10K(10，000×g)或100K(100，000×g)离心后的颗粒绝大多数为外切体。经过粗胞外小泡的梯度分离，我们观察到KrasG12D蛋白是10K或100K离心后的蛋白质中的主要存在，但不是2K(2，000×g)离心后的蛋白质(图2H)。用蛋白酶K(一种蛋白酶)或Triton
X-100(一种典型的非离子洗涤剂)对100K外切体小丸进行进一步处理。KrasG12D和PDCD6IP/Alix对蛋白酶K消化不敏感，但可被Triton
X-100降解。不知道作者为什么做这个，感觉画蛇添足了，而且和目前经典的外泌体提取方案不一致，况且怎么说明kras是外泌体递送的，而不是微囊递送的。反而外泌体在其中的作用受到质疑。这段验证我省了。但是，这却不影响作者继续据理力争。我们继续上面说的摄取的问题。外周血单个核细胞是不是也表达kras？作者验证了，并没有，但是，外泌体kras以时间依赖性方式聚集在外周血单个核细胞（PBMCM）中。那又是怎么摄取的呢？作者以往研究发现了AGE蛋白可以和KRAS结合，所以有验证了单个核细胞跨膜蛋白AGE在外泌体处理后细胞内KRAS水平，通过rescue实验证明了确实外泌体的摄取需要AGER的介导。上图。小疑问一下，为什么没有做免疫荧光验证外泌体于PBMCM的结合？外泌体的kras怎么和PBMCM膜上的蛋白结合的？
下面进一步要验证外泌体在TAM的作用机制以及TAM极化。TAM有两种表型：M1和M2，M1表型是促炎表型，M2是免疫抑制表型。M1分化的生物标志物(IL12A[白细胞介素12A]、TNF和NOS2/iNOS[一氧化氮合酶2])或M2极化(IL10[白细胞介素10]、ARG1[精氨酸酶1]和TGFB1[转化生长因子β1])。这里和外泌体就没有关系了，直接进入蛋白改变表型的阶段（我有个大胆的想法，直接在靶细胞过表达KRAS可不可以，没想到作者也这么干了）。敲除AGER也能抑制TAM转换为M2表型。脂肪酸氧化导致长链脂肪酸断裂成乙酰辅酶A单位，可以促进M2巨噬细胞极化，kras过表达也诱导了PBMCM的脂质过氧化。这个rescue实验只要抑制脂质过氧化就行了，这里用到了脂质过氧化抑制剂（etomoxir ）也抑制了M2表型蛋白的表达。是不是也该说说怎么导致的脂质过氧化了吧，作者又神来之笔拉来了核转录因子STAT3，这个厉害了，为什么会找到这个呢？真是好文自有天祝啊。又一系列验证证明了，总体路线kras-AGER-pSTAT3-脂质过氧化.作者又对脂肪酸氧化过程相关进行了一系列研究，就不列举了，反正就是脂肪的β氧化过程。
体外实验和机制都做完了，剩下的就是体内，动物临床了。别着急文章快完了。这种表型研究不需要太深入，只要证明kras在肿瘤中的作用就行了，还要补充TAMs相关表型验证。不得不服作者的脑洞，比我的还大，作者把PANC-1与PBMCM一起接种到裸鼠皮下，与单独注射PANC-1相比发现可以促进肿瘤生长。用抑制自噬、铁死亡和AGER抗体可以抑制肿瘤生长反应。在PANC1细胞(图4B)中ATG5的敲除或在PBMCM(图4B)中AGE的敲减减少了由PANC1细胞和PBMCMs产生的肿瘤的生长，还记得那个STAT3、CPT1A,rab27吗，这就安排上。作者脑洞新奇我也是服了，我只能说经费在燃烧，为什么敲除了PBMCM的A TG5、STAT3、CPT1A和RAB27A？作者还发现KrasG12D蛋白转移到PBMCMs可以通过一条涉及A TG5、STAT3、CPT1A和RAB27A的通路来推动PDAC的进展。Are you kidding？
补上临床数据：基础研究如果缺少临床内容那就没有了灵魂，马上安排。作者研究发现肿瘤组织中kras在CD68+巨噬细胞中增多，而且高表达组生存期比低表达要短。
至此，全文结束了，不得不服了，作者有些内容作的反而是画蛇添足了，如果加上免疫荧光可视化外泌体被PBMCM摄取过程就更好了，在做体内的过程中把肿瘤和TAM一起注射，其中促肿瘤生长的作用也只是人为作用，不能模拟体内真实情况，如果能证明注射肿瘤细胞可以动员PBMCM沉积于肿瘤组织并参与M2表型改变那就完美了。本文思路新奇，实验内容也比较严谨，正反验证应用的都很得当，就是一些设计部分不是太令人满意哈！！如有不足，请大家多多指正。
