一、DNA 聚合酶
分子克隆中的许多步骤都涉及在DNA 聚合酶催化下的DNA 体外合成反应。这些酶作用时大多需要模板，合成产物的序列则与模板互补。大多数聚合酶优先作用于DNA 模板，但也可拷贝RNA ，尽管这时效率较低。最常用的依赖于DNA 的DNA 聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶 I （全酶）、大肠杆菌DNA 聚合酶I 大片段(Klenow 片段）、T4 和T7 噬菌体编码的DNA 聚合酶、经修饰的T7 噬菌体DNA 聚合酶（测序酶及测序酶2.0 版），以及耐热DNA 聚合酶(Taq DNA 聚合酶和Amp1iTaqTM)。有一种聚合酶，即反转录酶（依赖于RNA 的DNA 聚合酶）可优先拷贝RNA ，但也可接受DNA 模板，因此能以RNA 为模板催化合成双链DNA。最后还有一种DNA 聚合酶，它根本不对模板进行拷贝，而只是将核苷酸加到已有的DNA 分子的末端，此种DNA 聚合酶叫做末端转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶）。
二 、依赖于DNA 的RNA 聚合酶
SP6 噬菌体可合成依赖于 DNA 的RNA 聚合酶，该酶识别双链DNA 模板上相应的噬菌体特异性的启动子，井沿此双链DNA模板起始RNA 的合成。利用该酶可以在体外合成大量与外源DNA 一条链互补的RNA。该外源DNA克隆于专门设计的载体中，并位于启动子的下游。已有一些专用的载体可通过改变外源基因上游的启动子的方向而合成与模板任一条链互补的RNA
(Butler 和Chamberlin, 1982; Melton 等， 1984) 。T7 和T3 噬菌休也能合成依赖于DNA 的RNA聚合酶，该酶识别双链DNA 模板上适当的噬菌体特异性启动子，井沿此双链DNA 模板起始RNA 的合成。
T7 和T3 噬菌体依赖于DNA 的RNA 聚合酶在体外的应用与SP6 噬菌体RNA 聚合酶完全一样。T7 和 T3 噬菌体RNA聚合酶已经在大肠杆菌中克隆井表达（ Davanloo 等1984; Tabor 和 Richardson, 1985; Morris等1986)。而且T7 噬菌体RNA 聚合酶也已在酵母中得到克隆和表达(Chen 等， 1987)。这样，带有T7噬菌体启动干的载体就可用于在体内表达克隆化基因 。
三、连接酶、激酶及磷酸酶
用于将两段DNA 拼接起来的酶叫连接酶。分子克隆中最常用的连接酶由T4 噬菌体编码。未受感染的大肠杆菌中还有一种用途较窄的连接酶。这两种酶主要作用于5’端带磷酸基团的DNA 底物。
RNA 连接酶也是一种T4 噬菌体编码的酶。该酶能使含5′ 磷酸末端及3’ 羟基端的单链RNA（或DNA) 共价连接起来，然而此酶的主要用途是对RNA 进行3’ 末端标记，也就是将32p 标记的3’,5’- 二磷酸单核苷(pNp)加到RNA 的3’ 羟基端。连接前，如果DNA 缺乏所需的磷酸基团，可用T4 噬菌体多核苷酸激酶处理，使DNA 磷酸化。相反，用酶除去5’磷酸基团后， DNA 便不再能够连接起来 。
四、核酸酶
能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，称为核酸酶。核酸酶属于水解酶，作用于磷酸二酯键的P-O位置。
核酸酶是在核酸分解的第一步中，作用于水解核苷酸之间的磷酸二酯键的一种核酸。在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的。
不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶（DNase），有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此统称为核酸酶（nuclease）。根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为核酸外切酶（exonuclease）和核酸内切酶（endonuclease）。
