类器官模型是一种新兴的体外模型，由具有干细胞性质的起始细胞分裂和分化，并将多种类型的细胞自组装的结构，自组装后的形态和功能与体内相应器官相似。具有构建周期较短、易于保存以及保留供体异质性的特点

以往关于肿瘤的研究局限在细胞模型或者动物模型，但是这些模型都具有一定的限制。细胞系往往已经失去原始供体的基因组特征，不具备个体异质性，这给精确预测具体患者对特定药物的敏感性带来了困难。运用人源肿瘤异种移植模型（patient-derived tumor xenograft，PDX）可以很好地解决这一问题，将供体的原位肿瘤移植入免疫缺陷动物，可最大化地保留供体的异质性。但PDX模型的建立需要时间较长，且需要高昂的费用，不利于高通量的药物筛选。

类器官的出现是的我们可以在体外更加高效且真实的模拟肿瘤在体内的各方面特性，以基础研究及其临床应用的转化提供了更加先进的工具和桥梁

类器官的出现和发展

2009年，Hans Clevers团队在Nature杂志上发表突破性成果，首次在外体培育出了结直肠上皮类器官。文中，研究者将肠上皮组织消化为肠隐窝结构或单个Lgr5+干细胞，并包裹于基质胶（matrigel）中，再加入含有表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）、Wnt信号通路相关蛋白R-spondin 1、Noggin蛋白的培养基进行培养。由于Matrigel具有支撑作用，利用肠隐窝底部Lgr5+干细胞的增殖分化能力，消化获得的肠隐窝结构或单个Lgr5+干细胞能够向各个方向生长，从而形成了包含肠上皮隐窝和绒毛样结构的3D组织球。经免疫荧光染色、免疫组化及电镜观察，发现其中包含了肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞以及Lgr5+干细胞等多种细胞种类，并具有肠上皮相似的结构。

这些类器官模型的共同特点都包括：

1. 由相应供体器官的多种特征性细胞构成，相比单细胞模型能够更好地模拟供体器官的特性；

2. 具有供体器官的部分功能，如排泄、过滤、收缩、神经活动等；

3. 与供体器官具有相似的组织排列形态和空间结构。

类器官生物样本库的建立

利用手术切除的肿瘤样本培养类器官，成功率较高可达90%，并且传代后均可冻存，复苏后的存活率可达80%以上
在没有新鲜样本的情况下，也可以将人结肠癌、甲状腺癌、肺癌、肾癌和肝癌的手术组织切碎后，以梯度降温的方式进行冷冻，最终在液氮中保存15-18个月后进行复苏和原代细胞提取，分别对细胞进行2D和3D培养，证实了冻存对于细胞活力和生长速度均无显著影响。但是新鲜组织提取的细胞依然是3D培养的最佳选择
经过HE染色，可发现类器官形态规则，很大程度上保留了供体组织的形态学特征。基因组检测发现其突变率和供体类似。进一步证明了类器官模型可以用于肿瘤患者个体水平的基因组及其功能的研究，且具有耗时短、高通量的特点，这是传统细胞系模型及PDX模型所无法做到的。并且由于类器官可以很好地保留供体组织的异质性，可以用于高通量的高敏感度的药物敏感性检测，为患者制定个性化的治疗方案，具有很高的应用价值。

培养方法

分离培养步骤

1. 人原代组织准备：

注：涉及到人原代组织的研究必须符合所有相关的机构和政府规定。
在收集人原代组织材料之前，必须得到所有受试者的知情同意。
目前培养的类器官主要来源于上皮细胞

1）收集人原代组织块，按活检部位和/或组织类型（比如正常组织和肿瘤组织）分开放在 50 mL 锥形管中，每管含有 45 mL 冰预冷的 adDMEM/F12+++ 培养基【「+++」表示含有以下三种试剂：adDMEM/F12 培养基 + 100 U/mL penicillin-streptomycin + 10 mM HEPES + 1× (vol/vol) GlutaMAX，在 4°C 保存 ≤ 1 月】。adDMEM/F12+++ 培养基中建议加入 10 μM ROCK 抑制剂（Tocris，Y-27632，货号 1254），以提高细胞存活能力。将组织样本保存在这种培养基中，置于 4°C，直至开始分离。

注：根据原代组织来源的不同，组织块可在 4°C 下保存至多 72 小时
而不会造成类器官生长的明显损失，但是建议尽快进行下一步。

2）评估获得的组织块是否仅由上皮组成，还是包含脂肪或肌肉组织。如果包含脂肪或肌肉组织，在解剖显微镜下用手术剪刀或手术刀和镊子尽可能去除非上皮成分。
注：非上皮组织可能会延长消化成单细胞的时间，或导致过高估计具有类器官形成能力的（上皮）细胞数量。
3）在 10 cm 的细胞培养皿中，使用手术剪刀或手术刀将组织切成1～3 mm3 的小块。
4）根据肿瘤类型适当消化组织。消化液一般以胶原酶为主（肠：II、IV 型；肺：I、II 型；肝：IV 型），浓度为 400～1,000 U/mL，附以分散酶，核酸酶 5～20 U/mL。消化液现用现配，37 ℃ 预热。在消化过程中添加 10 μM ROCK 抑制剂可提高生长效率。如下为结直肠消化液举例可供参考。

结直肠消化液

仔细观察消化情况，因为过度消化会显著降低生长效率。
根据经验，在观察到细胞簇（由 2～10 个细胞组成）的混合物时，消化就完成了。
在开始培养新的组织类型时，建议在消化过程中取少量样本并铺板，
以确定这种特定组织的最佳消化时间。

5）当混合物变得浑浊且剩余的组织碎片被破碎时，使用 P1000 移液器上下吹打 10～20 次，进一步促进组织破碎。从顶部加入 10 mL adDMEM/F12+++ 培养基，并在** 4℃ 下以 200 g 离心 5 分钟，对细胞进行清洗。
6）将沉淀重悬在 10 mL adDMEM/F12+++ 培养基中，并用 70～100 μm 细胞滤网进行过滤。
7）对重悬和过滤后的细胞进行离心**，在 4°C 下以 200 g 离心 5 分钟。

如果过筛后的细胞沉淀呈红色，可能有血红细胞污染
建议加入 5 mL 红细胞裂解液 4°C 处理 5 分钟。
完成裂解后，在 15 mL 管中加满 PBS 清洗一次，然后在 4°C 下 500 g 离心 3 分钟。

2.类器官培养

8）重悬包被：吸出上清液，将沉淀重悬在 BME（推荐 R&D Systems® Cultrex RGF，货号 3536-005-02、BME001-10）中。BME 应置于冰上，以防止其凝固，因而操作时应当迅速。BME 的用量取决于沉淀的量。大约 10,000 个细胞应接种在 40 μL BME 中。

BME[Basement Membrane Extract]:基质胶/基底膜提取物
提取于Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 小鼠肉瘤，在37℃重新形成基底膜
其主要成分是laminin, collagen IV, entactin, HSPG等
还包含生长因子如TGF-beta，EGF，IGF，FGF，组织纤溶酶原激活物和EHS肿瘤自身含有的其他生长因子
主要用于支持细胞生长和分化
也用于细胞粘附、血管新生、提取外细胞迁移/侵袭和体内成瘤实验等。

切勿过度稀释 BME【BME 应当 > 70%（体积比）】
以确保能形成固化液滴

9）加样：将类器官和 BME 的混合物滴在预热的 24 孔悬浮细胞培养板的底部，每滴约 10 μL。在每孔中放置 3～4 滴。

● 类器官一旦悬浮在 BME 中，应尽快进行铺板，因为 BME 可能在管中或移液器吸头中凝固。

● 培养板应置于 37℃ 的加湿培养箱中，预热过夜。
如果未正确预热，BME 液滴会立即平铺在培养板的表面，并且类器官更容易附着在培养板的底部。

10）凝固：将培养板置于 37°C、5%（体积比）CO2 加湿培养箱内，孵育 20～30 分钟，使 BME 凝固。
11）培养基配置：准备所需量的类器官培养基（培养基配方请见下表），并添加 10 μM ROCK 抑制剂和原代细胞抗生素 Primocin（100 μg/mL），然后将培养基置于 37°C 水浴中。对于头颈部类器官，在人头颈部类器官培养基中额外添加 0.5 μg/mL 卡泊芬净（caspofungin）。

培养基培养示例

12）添加培养基：一旦 BME 液滴固化（30～60 分钟），翻转培养板并在每孔中小心加入 500 μL 类器官培养基。

切勿直接在 BME 微滴的顶部加入培养基，因为这可能会破坏微滴结构。

13）培养：将培养板置于 37℃、5%（体积比）CO2 加湿培养箱内。
14）每 2～3 天更换一次培养基，从各孔中小心吸出培养基，然后加入新鲜的预热培养基。在前两次传代时，在培养基中添加 ROCK 抑制剂和Primocin。

● BME 微滴可能会从悬浮培养板上脱落，在培养基中[游动]。
  在这种情况下，我们建议对类器官进行重新铺板，不要使用 TrypLE 来解离类器官。
  密切监控类器官的形成。理想情况下是在最初铺板后的 12～14 天内对类器官进行首次传代。

● 切勿过早传代（Splitting）类器官，因为这可能会造成培养终止。

● 在第一次传代时，确保培养物达到最佳密度
（根据经验，每 40 μL 培养物中含有 10,000 个细胞）。

3.传代

→多久传一次？
类器官的传代通常是根据培养的时间判断。
一般在7-14天时进行第一次传代，后续则每7-10天传代一次。
→传多少次？
大部分类器官可以在体外连续传代10次（>6个月）
甚至有些类器官可以连续传代20次（>12个月）并且维持原有的生长速度。

1）上下吹打以破碎基底膜提取物（Basement Membrane Extract ，BME），然后将类器官悬浮物转移至** 15 mL 锥形管中。
2）为了促进 BME 的去除，从顶部加入 10 mL 冰预冷的 adDMEM/F12+++ 培养基。
3）类器官在 4°C 条件下以 200 g 的转速离心 5 分钟**。
吸出上清液，采用 TrypLE 或机械破碎来分解类器官，前者适用于头颈部和紧实的乳腺、结肠、胰腺和肝脏类器官，后者适用于卵巢和囊性的乳腺、结肠、胰腺和肝脏类器官。

几种消化液
1. 胰蛋白酶（trypsin）：胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织使用。
常用的胰蛋白酶液的浓度是0.25%和0.125% ，作用温度是37℃或室温，pH 7.4左右。-20℃冻存。
Trypsin 的缺点：
细胞损伤大－Trypsin 抑制剂需要将酶快速灭活，这会导致细胞损失或死亡。
冷冻保存－Trypsin 必须保存在－20 ℃，在经过多次反复冻融或在 4 ℃ 长期保存后，稳定性丧失。
批间差异大－Trypsin 为动物源性，批次之间差异性大。
2. Tryple 
细胞损伤小－TrypLE 为非动物源性的消化酶，更纯，对细胞损伤更小，提高种板效率。因为 TrypLe 作用细胞温和，不需要 Trypsin 酶抑制剂。可以直接用 PBS 终止消化
室温保存稳定性高－TrypLe 可以稳定的保存于室温，节省了冷冻空间，同时提供即时可用的便利。
应用范围广－TrypLE 是在有血清或无血清环境中培养的多种不同细胞系的理想选择，可以直接替代您现有步骤中所用的 0.25% trypsin
室温稳定性高 - 工作储存温度可以为室温保存 6 个月或 37 ℃ 一周后酶活性仍不丢失

➣ 在采用机械破碎时
将沉淀重悬在 3 mL adDMEM/F12+++ 培养基中。
在移液器上装上 P1000 带滤芯吸头和（不带滤芯）P10 吸头，上下吹打类器官悬液 30 次。
枪头紧靠管的底部来产生更大压力，有助于类器官的分解。
➣ 在采用 TrypLE 解离细胞时
将沉淀重悬在 1 mL TrypLE 中，上下吹打并在 37°C 条件下孵育，直至类器官分解。
在移液器上装上 P1000 带滤芯吸头和（不带滤芯）P10 吸头，每 3～5 分钟上下吹打 ≥ 10 次，以促进类器官的分解。
密切监控消化过程，尽量缩短 TrypLE 的孵育时间

● 使用 TrypLE 解离不要超过 15 分钟，因为这可能导致类器官生长不佳，甚至培养物损失。
根据经验，在观察到小块细胞（由 2～10 个细胞组成）的混合物时，消化即已完成。
● 如果在为药物筛选做准备，则不完全消化产生的大块细胞或完整的类器官碎片将导致类器官产量很低
因为在制备药物筛选的类器官悬液时这些过大的细胞和碎片都会被过滤掉。

5） 在消化完成后，用 10 mL adDMEM/F12+++ 培养基清洗。
6）第 8～11 步所述，将类器官沉淀重悬在 70%（体积比）BME 中，并以小液滴的形式铺在预热的培养板底部。在铺板完成后，翻转培养板并将其置于 37℃、5%（体积比）CO2 加湿培养箱中，孵育 30～60 分钟。
7）将含有 10 μM ROCK 抑制剂的类器官培养基预热至 37℃。
8）在 BME 微滴凝固后（30～60 分钟），向各孔中小心加入预热的培养基。
9）将培养板置于 37℃、5% CO2 加湿培养箱中，直到类器官要用于药物筛选。或者用于后续的冻存和复苏步骤。

4. 冻存

类器官可以冻存，通常会在传代2-3次之后选择冻存。为了达到最佳的效果，可以选择类器官成熟（传代7-10次）后再进行冻存。

10）在类器官传代 2～3 天后，去除培养基，向各孔中加入 500 μL adDMEM/F12+++ 培养基。利用 P1000 带滤芯吸头来分散 BME 微滴，然后将其转移至冰预冷的 15 mL 锥形管中。

为确保在清洗时去除 BME，最多可将 24 孔细胞培养板的 12 个孔合并在 15 mL 锥形管中。
如果要用更多的材料，则每次培养时使用多支管，之后在准备类器官用于筛选时合并。

11）（可选）如果存在大量 BME，则在含有类器官的 15 mL 锥形管中加入冰预冷的 adDMEM/F12+++ 培养基，使其总体积为 12 mL，并用预先（用 adDMEM/F12+++）润湿的 10 mL 血清移液管上下吹打，再置于冰上 10 分钟。在此期间用 10 mL 血清移液管吹打数次。将样本在冰上放置更长时间会进一步溶解 BME。
12）类器官在 4°C 条件下以 200 g 的转速离心 5 分钟。
13）吸出上清液，不要扰动沉淀。
14）加入所需体积的细胞冻存培养基（例如商业化冻存试剂或 90% FBS + 10% DMSO），并用 P1000 移液器上下吹打，彻底重悬类器官。

24 孔细胞培养板中 4 个「原始」孔培养的类器官，对应使用 500 μL 冻存培养基。

15）在每个无菌的冻存管中加入 500 μL 带有重悬类器官的冻存培养基。
16）将冻存管保存在 -80℃ 冰箱中，24 小时后，取出冻存管，将其转移至液氮罐中（约 -180℃）。

冷冻保存的类器官可在液氮罐中保存数年。

5. 复苏

17）将带有冻存类器官的冻存管从液氮罐转移至干冰上。
18）对于每个要复苏的冻存管，在室温下准备一个装有 10 mL adDMEM/F12+++ 培养基的 15 mL 锥形管。
19）将冻存管放入 37°C 水浴中，孵育 1～3 分钟。

仔细监控解冻情况，并在冻存试剂解冻后立即从水浴中取出冻存管。为了预留走到超净台所需的时间，可以考虑在仍有少量冰块时取出冻存管。

20）在冻存管中逐滴加入 1 mL adDMEM/F12+++ 培养基，同时不断混匀，然后将冻存管中的全部内容物（包括类器官）转移至 15 mL 锥形管中。在锥形管中加入 adDMEM/F12+++ 培养基，使其总体积为 10 mL。
21）类器官在 4°C 条件下以 200 g 转速离心 5 分钟。
22）吸出上清液，不要扰动沉淀。
进行6-9的铺板

根据复苏类器官的（溶液）体积，如果在清洗过程中冻存试剂未能达到至少 10 倍以上的稀释，则应增加额外的清洗步骤，以确保冻存试剂在铺板前得到充分稀释。

参考文章：
https://mp.weixin.qq.com/s/8X0KaMFVdhw4sBGIOnnshg
https://mp.weixin.qq.com/s/vMSHMs9XtdldIdh6c5i9vg
https://mp.weixin.qq.com/s/xwnhC8h5X6HEnKN1FowJMQ
耐药微环境类器官https://mp.weixin.qq.com/s/vLTtcOUO12hFo9OGoRk6Mw