基因疗法是治疗遗传性疾病的一种极具潜力的方法，在体内进行基因替代治疗已成为现代医学中引人注目的概念之一。腺相关病毒（AAV）载体被广泛应用于此类治疗中，并在多种动物模型中显示出治疗效果。虽然将这一成果成功转化为临床治疗起初进展缓慢，但如今已经在遗传性视网膜疾病和血友病B患者中实现了相关基因的长期治疗水平的持续表达。最近的研究结果令人兴奋，为治疗其他疾病带来了希望。然而，正如我们在这里所讨论的，AAV基因疗法的前景和挑战在很大程度上取决于治疗的目标组织和具体疾病的特点。

引言

遗传性疾病在疾病负担中占据重要地位，儿童医院的住院人数中高达70%是由遗传性疾病引起的，成人医院的住院人数中也有10%与此类疾病相关。此外，许多常见的遗传性疾病，如地中海贫血、囊性纤维化和镰状细胞病，除了支持性护理外，仍然缺乏有效的治疗方法。人类基因组计划最初的预期目标之一是通过找出导致这些疾病的基因，从而促进遗传性疾病的更好治疗。而实现这一目标最直接的方法就是开发基因治疗技术。基因治疗的临床试验始于20年前，近年来成功治疗人类遗传性疾病的报道逐渐增多。事实上，已经有首个基因治疗药物针对遗传性疾病提交了许可申请，为这一领域带来了新的希望。

目前，通过基因疗法治疗遗传病的大多数策略都围绕着两种类型的载体：慢病毒用于将基因转移到造血和其他干细胞中，腺相关病毒（AAV）用于将基因转移到载体具有滋养作用的后生组织中。目前，治疗遗传疾病的基因治疗策略主要集中在两种类型的载体上：lentivirus（慢病毒）用于体外基因转移，针对造血干细胞和其他干细胞；adeno-associated virus（腺相关病毒，AAV）用于体内基因转移，针对对该载体具有亲和性的有丝分裂后组织（postmitotic tissues）。临床经验表明，这两种不同方法的毒性情况是不同的，与插入突变有关的风险是慢病毒（和其他整合）载体的主要安全问题，而限制疗效的免疫反应是使用AAV载体进行体内基因转移的主要障碍（BOX 1）。在此，我们重点介绍了利用AAV进行遗传病体内基因递送的最新进展。 虽然其他病毒也被用于这种类型的基因治疗（框2)，但迄今为止最有希望的结果是使用AAV（表1）； 近年来，AAV在先天性失明和血友病等疾病中的应用取得了令人振奋的进展，这些结果使基因治疗更接近临床应用。

BOX 1 基因治疗的潜在并发症

尽管基因治疗在小型和大型动物模型中取得了显著的成功，但一系列问题限制了其在人类中成功应用的范围。在过去的十年中的临床研究中，已经确定了几个主要的基因治疗障碍，如下所列。通常情况下，针对每种特定的载体、转基因和目标组织组合，可能会出现一到两个主要问题，这些问题成为临床应用中的主要障碍。

基因沉默

基因沉默可能是由于启动子甲基化导致治疗性转基因表达丧失。在一项针对X连锁慢性肉芽肿疾病的逆转录病毒介导基因递送的临床研究中，首次记录到了基因沉默现象。其中，一个最初从治疗中受益的患者最终因疾病本身的并发症而去世。在患者去世时，研究显示60%的粒细胞携带治疗基因，但只有不到10%的粒细胞表达该基因。

插入突变

这是由于治疗载体基因组在宿主DNA中的随机整合所导致的结果。首次在针对X连锁重症联合免疫缺陷的逆转录病毒介导基因转移的临床研究中报告了该现象，其中载体基因组在LIM domain only 2 (LMO2) 原癌基因中的整合导致了恶性肿瘤。在以非整合性载体（如腺相关病毒-AAV）为主要载体的临床基因转移研究中，没有报道载体引发的恶性肿瘤。尽管小鼠的临床前研究表明AAV载体可能在宿主基因组中整合，但整合介导的突变风险似乎很小。

表型毒性

Phenotoxicity可以由捐赠基因的过度表达或异位表达引起。关于基因递送可能存在的这种风险的报道主要限于临床前研究。例如，格林姆（Grimm）等人的研究显示，在使用AAV载体过度表达短发夹RNA时，小鼠会出现急性毒性反应。

免疫毒性

这指的是对载体或转基因产物产生的有害免疫反应。一些临床研究中观察到针对AAV衣壳抗原的T细胞活化，其中部分研究发现这种免疫反应与治疗效果的减弱相关。在动物模型和最近的肌萎缩性侯汉氏症AAV基因递送的临床研究中，也发现了转基因产物引发的免疫反应。

Horizontal transmission of the donated DNA

在体内基因转移后，载体释放的风险与给药后的时间和给药的载体剂量成正比。使用AAV进行的人体研究表明，在系统性载体给药后，载体可以在体液（如血清、尿液和精液）中存在数周，但之后会消失。临床前研究表明，非人类灵长类动物体液中释放的载体在72小时后不再具有传染性。

Vertical transmission

这指的是不经意地将捐赠的DNA传递给生殖细胞。人体内给予AAV载体后，最初对生殖细胞的转导引起了一些担忧。在血友病B犬的临床前研究中，并没有预测到会发生生殖细胞的转导，但通过兔模型进行的研究解决了这些担忧，结果显示几种不同血清型的AAV并不通过雄性配子传递。

BOX 2 用于遗传疾病的体内基因转移的基因递送载体

腺相关病毒载体

在基因治疗遗传性疾病的临床研究中，广泛采用了腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体。这些载体是通过改造细小病毒科中的一种病毒而得到的，作为基因传递工具，具有许多优势特点。这些载体对于一些非增殖、寿命较长的细胞类型具有亲和性，因此即使没有整合到宿主基因组中，也能实现长期的基因表达。此外，野生型AAV感染不会引发已知疾病的发生。

重组病毒由二十面体的病毒外壳组成，它在适当的启动子控制下包裹着相关的治疗基因。重组病毒颗粒的直径约为20-25纳米。野生型病毒的基因组有4,675个核苷酸，重组病毒颗粒可以包装高达约5 kb的DNA序列。野生型病毒在自然状态下无法复制自身，只能在存在辅助病毒（如腺病毒或单纯疱疹病毒）的情况下进行复制。一种常用的制造方法是将经过改造的哺乳动物细胞系转染三个质粒：第一个质粒包含所需治疗基因，该基因被克隆在两个病毒反向末端重复序列之间（这些序列有助于将基因包装到病毒外壳中）；第二个质粒编码AAV的外壳和复制相关基因；第三个质粒编码腺病毒所需的辅助功能基因。大约经过48-72小时，细胞被破裂，然后从细胞裂解物中纯化出重组病毒颗粒。

从人类和非人类灵长类动物中已分离出许多种AAV血清型。这些血清型在对各种目标组织的靶向性上有所不同，包括肝脏、骨骼肌、心肌以及中枢神经系统中的细胞，包括光感受器和视网膜色素上皮细胞。 Within the host cell, the genome of the recombinant virion persists predominantly in an episomal form, as concatemers of vector DNA. 载体DNA与宿主细胞基因组的整合可以发生，通常发生在活跃转录基因和双链断裂的部位。

过去十年的一个研究重点是确定哪些血清型在各种目标组织中达到最佳效果。另一个重点是改进制造工艺，以达到更高的产量和更好的纯度。这一领域的进展使许多最近的临床研究得以进行。对于需要高剂量载体的大规模试验，还需要进一步的改进。

用于体内基因递送的其他载体

其他几个病毒载体已被用于体内基因递送的临床试验（见全球基因治疗临床试验数据库）。在血友病A的试验中，使用编码因子VIII的逆转录病毒载体被证明是安全的，但没有达到治疗水平的持续表达。目前正在进行临床研究，利用慢病毒载体对中枢神经系统进行基因传递治疗帕金森病。但迄今为止，大多数临床应用慢病毒载体的情况是在体外将基因传递给造血干细胞。最初的腺病毒载体引起了激烈的免疫反应，其中一项试验治疗鸟氨酰转移酶缺陷症导致了患者的死亡。在囊性纤维化患者中，将腺病毒载体引入呼吸道是安全的，但没有显示出疗效。一项治疗血友病A的试验中使用的fully deleted腺病毒载体导致了血小板减少和转氨酶升高，因此该研究被中止了。然而，随着对fully deleted腺病毒载体工程和纯化技术的不断改进，已经在非人类灵长类动物中取得了有希望的结果，这表明这些载体仍有可能在治疗遗传疾病方面发挥作用。

对于AAV的临床应用而言，存在一些具体的组织特异性挑战。例如，免疫反应对于体内基因递送提出了重要挑战，而不同组织的免疫反应程度各异。此外，目标组织在其他方面也存在差异，比如在免疫损伤下的再生能力以及最适合的基因递送方式。因此，虽然AAV介导的基因转导面临一些普遍的挑战（见框3），即使是针对同一组织，也必须考虑特定疾病的特殊情况。本综述主要关注于特定组织的治疗性转基因输送方面的进展和挑战，包括视网膜、中枢神经系统（CNS）、肝脏和骨骼肌。这些组织被认为是离临床应用最近的目标，但同时也在积极研究其他目标组织，如肺部、心脏和关节。最后对迄今为止所取得的经验教训、尚存的挑战以及未来应用的前景进行了分析。

BOX 3 基因治疗的目标与挑战

除了某些例外情况（例如，利用锌指核酸酶进行基因组编辑），基因治疗遗传疾病的两个目标是实现目标基因的长期表达，并使转基因产物达到治疗所需的高水平。非整合型载体的体内基因递送通过将载体引入长寿命的postmitotic目标组织，如骨骼肌、心肌、中枢神经系统细胞或肝脏组织，从而实现长期表达。即使提供的DNA没有整合到宿主细胞的基因组中，只要载体DNA能够稳定保持，就可以实现持久表达。Episomal maintenance is the mechanism，如AAV和依赖辅助的腺病毒等载体能够实现长期表达。这种方法的优点在于大大降低了与载体整合相关的风险。缺点是大多数感兴趣的目标细胞无法被移除、在实验室中进行处理并返回给患者。因此，基因转导必须在体内进行，并且必须直接应对人体的免疫反应。

基因转移策略可以分为三个关键要素：载体或基因递送工具、转基因和目标组织。由于人体免疫反应是体内基因转移的主要障碍，并且人体免疫反应在不同组织中具有特异性，因此针对每个目标组织进行基因转移都存在一系列独特的挑战并不令人意外。因此，对于一个目标组织实现基因递送的解决方案可能不容易适用于其他组织。此外，通过不同的给药途径将载体传递到相同组织可能会面临不同的障碍。例如，直接肌肉注射进行基因传递似乎不会受到循环中的载体抗体的影响，但通过血液传递到肌肉的载体必须克服中和抗体的影响。最后，根据目标组织的不同，对转基因产物或载体的免疫反应可能占主导地位，这凸显出在临床环境中实现最佳结果必须解决的另一个问题。

视网膜基因递送

在临床基因转移中使用AAV载体取得的最成功的例子是治疗视网膜退行性疾病Leber氏先天性黑蒙症（LCA）。这种临床表型具有早发性失明和常染色体隐性遗传特点，可以由14种不同基因的突变引起。其中对于RPE65（编码视网膜色素上皮特异性65 kDa蛋白的基因），通过在视网膜下注射表达RPE65的AAV载体，已经在基因工程敲除小鼠和自然发生的狗疾病模型中实现了长期治愈。

在模型生物中取得成功后，2007年，英国的一个团队和美国的两个团队开展了针对由RPE65缺陷引起的LCA基因治疗试验（图1）。对于载体和转基因产物的免疫反应很小，这是一个预料之中的结果，因为试验涉及向一个免疫豁免区输送低剂量的载体，迄今为止注射的25多名受试者中没有发生严重不良事件。随后的一年，这三个团队报告了通过视觉功能的视觉功能（视力和视野）、客观指标（如瞳孔光反应或全视场光敏度）和功能测量（如在昏暗光下穿越障碍物的能力）来确定成功，并且几乎所有受试者的某些参数都有所改善。这些改善已经持续了3年以上的时间。

在视网膜退行性疾病中，RPE65缺陷的一个不寻常特征是尽管没有视觉，光感受器细胞相对较长时间保持完整。因此，在补充缺失的酶后，可以恢复视觉，因为光感受器细胞仍然存在。动物模型的临床前研究明确表明，视觉的恢复在较年轻的动物中最为成功，并且临床试验的结果在人类中证实了这一发现。长期失明的受试者恢复视力为研究人员提供了独特的机会，可以评估长期感官剥夺后视网膜功能恢复对视觉皮层的影响。这些受试者的功能性磁共振成像研究将帮助研究人员了解在长期严重视力障碍后，视觉皮层神经元对视网膜功能恢复的响应。这些研究揭示了基因治疗在增进对疾病病理生理的理解以及确定疾病可逆性边界方面的潜力（determine the boundaries of disease reversibility）。

持续进行中的临床试验和计划中的试验可能会改变眼科实践的某些方面。以往由于缺乏治疗手段，对具有遗传性视网膜退行性疾病的个体进行基因型分型并不那么重要，但随着进展的持续，这将变得重要起来。此外，对于玻璃体视网膜外注射技术的需求将增加，需要具备这方面专长的玻璃体视网膜外科医生。DNA诊断技术的快速发展也正在扩大新生儿筛查的范围，将来可能在出生时就能识别受影响的个体。

基因治疗视网膜退行性疾病的长期目标是在最有可能产生最佳结果的疾病阶段进行双侧治疗，这通常是在诊断后尽可能早的阶段。因此，该领域将需要在生命早期确定双侧给药的安全性。如果能在3岁的儿童中安全地进行给药，这将为其他视网膜退行性疾病提供重要的支持数据，特别是对于这些疾病中光感受器存活时间不长且早期治疗对于视力恢复至关重要的情况。

这些有希望的针对RPE65缺陷引起的LCA的基因治疗研究为基因治疗提供了更为普遍的启示。首先，它们强调了对许多遗传疾病至关重要的一个问题：基因治疗在疾病发展阶段对临床结果的影响。虽然这一点在致命的退行性疾病（如杜氏肌营养不良症或巴顿氏病）中最容易理解，但在视网膜退行性疾病等疾病中也同样适用。甚至对于血友病而言，超过一定阶段后，由于反复关节出血引起的渐进性损伤将不再可逆，即使恢复正常凝血因子水平也无法逆转。另一个值得强调的观点是，新型治疗方法（如基因转移）的早期发展在很大程度上取决于临床研究中最初选择的疾病模型。尽管RPE65缺陷由于疾病人口规模较小一直无法吸引商业支持进行临床试验，然而，这种疾病的概念验证为许多更常见的遗传性视网膜退行性疾病（如Leber遗传性视神经病变，choroideraemia and X‑linked retinoschisis）以及与年龄有关的疾病，如老年性黄斑变性的试验奠定了基础。

肝脏基因递送

肝脏作为主要的合成器官之一，仍然是基因转移研究中非常理想的靶点。成功地实现对肝脏的长期基因转移不仅有潜力治疗各种血浆蛋白缺乏症，还可以治疗代谢性疾病，如鸟氨酸转氨酶缺乏症（OTC缺陷）、甲基丙二酸血症、家族性高胆固醇血症综合征，以及一些溶酶体贮积病的生化（但不一定是中枢神经系统）效应。事实上，在小型和大型动物模型中已经实现了许多此类疾病的长期治愈（表2）。在临床领域的成功一直比较缓慢，但最近的研究表明，目前正在朝着长期表达的目标进展。

肝脏给药治疗血友病B

到目前为止，唯一对肝脏进行AAV（腺相关病毒）治疗的试验是针对严重血友病B的试验，这是由于血液凝血因子IX基因突变引起的出血性疾病。目前该疾病通常通过静脉输注凝血因子浓缩物进行治疗，但这些治疗方法相当昂贵（对于严重疾病的成年人进行预防性治疗，每年费用超过20万美元），而且估计全球只有约20%的血友病患者能够承担这些治疗方案。对于最贫困的人群来说，这种疾病在儿童或青少年时期仍然是致命的。除了这种未满足的需求，还有一些其他因素使血友病成为肝脏基因转移的理想目标：治疗窗口宽广（将因子IX水平提高到正常水平的>2%将改善表型，而水平高达150%仍然在正常范围内）；终点易于测量；并且已有小型和大型动物模型可用于该疾病的研究。

AAV-因子IX肝脏试验最初是基于在两个血友病B犬模型中进行的临床前研究中得到了强有力结果，并结合了在八名患有严重血友病B的患者中进行的类似临床试验的AAV载体编码因子IX的安全性结果。犬模型的研究显示，不论是通过肝动脉还是门静脉给予载体，都可以长期表达犬因子IX，并且在向肝脏注射载体后未观察到抑制性抗体的产生。随后的研究进一步证实，从AAV载体在肝脏中转录的转基因产物有助于促进对其的耐受性。这一结果也在使用其他载体，如慢病毒载体和γ-逆转录病毒载体进行的研究中得到了验证。

第一次AAV-因子IX试验使用了带有肝特异性启动子的AAV2载体（图2a），并通过肝动脉给予载体。AAV-因子IX肝脏试验的启动面临了几个障碍。首先，此前从未在人体肝脏中使用AAV载体进行过治疗，而且在那时，基因治疗试验中唯一的死亡事件发生在一项使用腺病毒载体在OTC缺陷患者肝脏中进行的试验中。因此，监管机构合理地要求AAV试验从低剂量开始进行。尽管有这些限制，但在一个受试者中明确展示了疗效，最高剂量测试时循环因子IX水平达到正常水平的10-12%。然而，增高的因子IX水平仅持续约10周（图2b），因此未能实现另一个关键目标，即长期表达，并且有怀疑认为转导的细胞被有选择性地丢失或破坏了。第二个受试者在治疗前未显示出因子IX表达或转氨酶升高的迹象，但在治疗前已检测到对AAV的中和抗体，据推测这些抗体阻止了肝脏转导（图2c）。之后试验进行了修改，以便收集外周血单个核细胞（PBMCs），结果显示CD8+ T细胞对AAV外壳蛋白产生了免疫反应（图2d），并暗示AAV-因子IX转导的肝细胞在细胞表面呈现了外壳蛋白来源的肽段，从而使得肝细胞成为活化的T细胞破坏的目标。有理论认为，这种反应在人类而非其他物种中出现，是因为存在一小部分记忆CD8+ T细胞，这些细胞在向受试者输注载体后进行增殖，导致转导的肝细胞被破坏（图3）。

这项研究阐述了在向循环系统中输注载体时可能出现的免疫反应相关问题。首先，它确认了中和抗体会阻止通过血液传递的载体转导，即使在靠近目标细胞（例如肝细胞的肝动脉）的位置输注也是如此。这在动物模型中已经得到了有力的证实，并且正在进行的人体试验结果似乎也证实了这些发现。其次，这些发现至少与一个假设一致，即在肝脏中从AAV载体表达转基因产物可能促进对该转基因产物的耐受性。第三，该研究表明，在向受试者输注载体后会引发针对外壳蛋白的特异性T细胞活化。随后的研究表明，这种反应与剂量有关，并且至少在几种其他AAV血清型中（包括AAV1和AAV8）也存在这种反应（详见下文）。然而，至今仍无法确定导致第一次肝脏试验中高剂量组中基因表达丧失的原因。记忆T细胞假设难以被证实或否定。一些替代假设被提出，但每个假设之间存在相互矛盾的证据，并且没有被证实或否定。然而，数据清楚地显示，人类与低等哺乳动物在抗原呈递和/或T细胞反应性方面存在差异。这些差异可能解释了为何一些动物研究未能在人类中重现相同的发现。相比之下，体外模型在研究AAV外壳抗原的处理和呈递、以及细胞毒性T淋巴细胞清除转导的人类细胞方面更加可靠。此外，需要强调的是，尽管免疫介导的对肝脏或骨骼肌的损伤通常是可逆的（因为这些组织具有较强的再生能力），但对心脏组织或中枢神经系统细胞的类似损伤可能不那么良性。

肝脏给药的未来前景

目前正在研究两种策略来避免在第一次肝脏试验中检测到的免疫反应。第一种策略是在向患者注入载体的同时，联合短期的免疫抑制治疗，试图阻止外壳蛋白特异性T细胞反应的激活和增殖，直到外壳蛋白已被降解并从转导的肝细胞中清除。第二种策略是研究人员开发了更高效的表达载体，以在剂量较低的情况下实现治疗水平的因子IX表达，从而避免引发免疫反应。这种载体更高效的特点包括：使用对肝脏具有强烈趋向性且可经静脉注入的AAV8亚型；使用自补充载体设计，克服对宿主细胞机制合成所需第二链的依赖；以及优化密码子，提高转录效率。在早期的肝脏试验中，以2 × 10^12病毒基因组（vg）/kg的载体剂量，达到了10-12%的循环因子IX水平。在使用AAV8的试验中，一个受试者在2 × 10^10 vg/kg的剂量下达到了2%的水平。剂量逐步增加到6 × 10^10 vg/kg后，两名接受输注的受试者中有一名达到了4%的循环水平。另一名受试者没有表达，但后来发现其在治疗前存在低滴度的针对AAV的中和抗体，这在初始筛查中未被检测出来。在这个第二个试验的前两个剂量组中，没有任何受试者的血清转氨酶发生任何变化。

由于使用基于PCR的方法来确定双链载体的滴度的复杂性，使得两个试验中剂量的比较变得困难。然而，第二个试验表明，可以稳定维持治疗水平的因子IX表达。仍有一些问题需要解决，其中首要问题是，在不出现毒性之前，剂量可以增加到多高？尽管已经测试过的剂量在血友病B治疗中已经达到了治疗水平的因子IX表达，但对于将来在肝脏中进行其他潜在应用的情况，这个问题可能是一个关注点。其次，对于具有针对AAV8的中和抗体的个体（约占总人口的30%），有哪些治疗选择？第三，目前在肝脏中研究的剂量下，这种以非整合性载体为主的载体整合以及由此产生的插入性诱变的风险是什么？

中枢神经系统的基因传递

已经进行了一些早期阶段的临床研究，尝试通过基因递送来治疗遗传性退行性疾病，特别是在中枢神经系统中。然而，这些研究在治疗视网膜退行性疾病方面并未取得明显的成功。

当前在基因递送到中枢神经系统方面，存在两个核心挑战限制着治疗的范围。首先是局部递送与全面递送的问题。虽然在某些疾病（如帕金森病）中局部递送已被证明具有治疗效果，但对于大多数神经退行性疾病，需要对中枢神经系统进行全面递送。第二个问题是血脑屏障（BBB），它是向中枢神经系统传递所有治疗药物的障碍。由于大脑是高度血管化的器官，静脉内途径的递送方式具有吸引力，但克服血脑屏障在这方面是一个挑战。该领域通过利用或改变病毒载体的特性以及探索一系列递送技术来应对这些问题。

载体：靶向性和改造

寻找适用于中枢神经系统基因递送的最佳AAV载体血清型是一个活跃的研究领域。通过AAV1介导的CLN2基因递送（该基因编码三肽基肽酶1（TPP1）），在晚期婴儿型神经细胞棕垢脂质沉积症（LINCL）的小鼠模型中已经显示出有希望的结果。近期研究发现，AAV9是一种新发现的血清型，它能够通过轴突传输将病毒颗粒运送到离注射部位较远的位置，显示出了高效的基因转导能力。目前的工作还致力于确定AAV载体对中枢神经系统中不同细胞类型（例如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞）的靶向能力。

对于基因传递到中枢神经系统的研究来说，通过改变AAV载体的外壳结构进行工程修饰，以改变其自然特性，是一个活跃的研究领域。陈等人利用溶酶体贮积病患者脑内血管内皮的疾病特异性变化，成功地将AAV载体的靶向性重定向到小鼠体内。他们发现了一些在疾病动物脑内血管内皮中唯一结合的多肽序列，并将其插入到载体的外壳蛋白中，从而实现了治疗性基因产物通过血管内皮传递到整个大脑的目标。这些基因产物穿过血脑屏障后，能够在患者的神经元和胶质细胞中实现相互纠正，并改善两种溶酶体贮积病模型（如LINCL和粘多糖贮积病VII型）小鼠的表型。类似的策略也被用于在药物诱导的癫痫大鼠中设计AAV载体，使其能够穿越血脑屏障。然而，需要进一步研究来确定人类脑内血管内皮的疾病的特异性分子特征，这可能与实验动物有所不同。

未经改良的AAV9载体，在中枢神经系统的基因递送中具有潜在的用途，因为它显示出穿越血脑屏障的能力，这一结果在小型和大型实验动物中已得到证实。然而，针对中枢神经系统的系统性AAV9基因递送仍存在一些潜在的障碍。首先，体液免疫会阻碍转导过程，使得达到治疗水平的基因表达变得困难。其次，为了在大脑中实现治疗水平的基因表达，需要使用更高剂量的载体。此外，还存在非特异性转导的风险，可能导致对心肌细胞等非目标组织的影响。对于这些障碍，需要进一步研究和改进，以提高AAV9在中枢神经系统基因传递中的应用效果，并确保其安全性。

递送技术

对于大多数影响中枢神经系统的疾病而言，全面递送至大脑是非常重要的。除了进行AAV血清型分析之外，还有其他一些递送技术已成功应用于非人类灵长类动物中的AAV载体递送。其中包括利用静水压通过血管周围间隙进行对流增强递送，使治疗物质扩散到大脑的远离部位。通过将载体注入脑室中，也已在动物模型中实现了对中枢神经系统的更广泛转导，这使得载体能够通过脑脊液（CSF）循环。目前还不清楚是否可以成功将这种或类似的经CSF途径（鞘内给药和延髓池给药）应用于人体，以实现对中枢神经系统的全面递送。总的来说，所有针对大脑的新技术在啮齿动物中的概念验证还需在大型动物模型中进行确认，以更接近人脑的结构和体积分布。

尽管全面传递仍然是一个挑战，但使用当前的立体定位注射技术可以实现对中枢神经系统的局部传递。因此，一些最初的临床工作已经着眼于帕金森病或阿尔茨海默病等疾病，因为局部传递可能会产生治疗效果。例如，通过立体定位注射将慢病毒载体携带的基因递送到受帕金森病影响的人类大脑中，虽然在大多数情况下帕金森病不是一种遗传疾病，但这是迄今为止神经退行性疾病取得最明显成功的案例。这种成功可能是因为立体定位注射的局部传递可以针对疾病的主要病理特点，即黑质中多巴胺神经元的退行性变化和对纹状体多巴胺输入的丧失。局部传递携带编码神经营养因子或神经递质代谢酶的AAV载体也已经被证明在约5 × 10^11 vg的载体剂量下是安全的；大多数不良事件与载体的管理过程本身有关，这与用于颅内注射的外科手术程序相关的风险是一致的。

研究人员还尝试使用向多个部位进行脑实质内注射的方式来处理需要在更大范围（即全面传递）进行基因递送的神经退行性疾病，尤其是对于Canavan病和Batten病这两种严重且致命的儿童神经退行性疾病。Canavan病是一种缺乏天冬酰胺酰化酶（ASPA）酶的疾病，对于这种疾病的AAV试验是最早将载体引入大脑的临床研究之一。将编码ASPA cDNA的AAV2载体以剂量高达1 × 10^12 vg的方式注入十名患有该病的儿童患者中。通过六个颅骨孔进行向脑部注射（每个孔一个注射点），并未出现意外的不良事件。该研究旨在评估安全性，尚未公布任何疗效数据。

在类似的方法下，Worgall和他的同事进行了一项关于Batten病的基因递送的临床研究，这是一种主要影响大脑的常染色体隐性溶酶体贮积病。Batten病的一个亚型LINCL是由CLN2基因突变引起的，该基因编码TPP1酶。在患有该疾病的十名儿童中，载体直接注入大脑实质，剂量为1.8-3.2 × 10^12颗粒单位，同样通过六个颅骨孔，但每个孔进行两次注射，共计12个注射点，全部位于大脑皮层。在这项研究中，其中一名患者在接受载体注射后的14天出现难治性癫痫，导致患者在载体注射后的49天死亡。脑成像和脑脊液分析未检测到脑炎，但未获得进行尸检的许可，因此无法确定这一不良事件是否与潜在疾病的进展、手术过程或研究中测试的药物有关。在其他患者中，一些改善被观察到，为同一研究团队最近启动的I/II期研究奠定了基础（ClinicalTrials.gov识别号：NCT01161576）。这项新研究使用相同的递送技术和表达载体，但将其打包到AAVrh10血清型中，而不是前期试验中使用的AAV2外壳。转换到这种血清型的决策基于小鼠模型的临床前研究，显示AAVrh10血清型在大脑中的分布范围更广，TPP1的表达水平更高，并与AAV2、AAV5和AAV8向量相比，疾病矫正效果更好。这些努力具有重要意义，但显然对于大多数神经退行性疾病，可能需要全面的中枢神经系统基因转移才能实现治疗效果。

递送至CNS的其他考虑因素

还有两个问题需要特别强调，这些问题涉及基因递送至中枢神经系统。首先，对于这些疾病来说，可能需要在中枢神经系统发生不可逆变化之前进行早期治疗干预，这一点与视网膜退行性疾病的情况相似。尽管有一些研究表明我们尚未完全了解中枢神经系统的可塑性，但根据酶替代疗法的数据，某些疾病进展可能是不可逆转的。其次，在开发这些以前无法治疗的疾病的临床研究中，面临着一个挑战，即缺乏明确定义的临床研究终点。这一挑战可能更加突出在患者人数较少、疾病进展的自然历史不明确以及尚未验证用于监测治疗效果的生物标志物的情况下。

骨骼肌基因递送

肌肉是基因递送策略中的一个理想靶组织，用于矫正神经肌肉疾病、代谢性疾病和遗传性蛋白缺乏症，如血友病B、α1-抗胰蛋白酶缺乏症和脂蛋白脂酶（LPL）缺乏症。通过肌肉的肌内注射是迄今为止最常用的向肌肉传递载体的途径，具有几个优势：传递过程简单易行并且已经广泛应用；向目标组织外传播的程度相对较小；预先存在的抗-AAV抗体不会阻碍转导。

相反，相较于其他靶器官（如肝脏），将AAV载体注射到骨骼肌通常更容易引发抗转基因免疫反应的风险增加。此外，肌纤维向循环系统的分泌效率相对较低，这对于血浆蛋白缺乏等疾病而言是一个问题，因为转基因产物的有效分泌至循环系统对于治疗的成功至关重要。此外，目前尚无能够在临床上实现对大多数肌肉组织（包括膈肌）进行转导的方法，而这对于杜氏肌营养不良等疾病的治疗效果来说是必需的。

肌肉注射给药

第一项关于AAV载体肌肉注射的临床研究始于1999年，用于治疗血友病B。基于对血友病犬的研究，很明显使用这种途径进行治疗会导致抗转基因产物因子IX的抗体形成的风险。因此，该试验限制在携带有错义突变引起的血友病B的个体中（这些个体对转基因产物表现出某种程度的耐受性），并排除了任何先前有蛋白质输注治疗导致抗体形成的历史的个体。在所有八名受试者中，基因转移都成功进行了；通过肌肉活检证实了基因的表达，并且该程序安全且耐受性良好。然而，循环中因子IX的水平较低，可能是由于所使用的剂量较低，低于根据血友病B犬研究预测的治疗剂量。尽管使用其他AAV血清型在小鼠中已经实现了增加的转导效率，但在血友病犬中的研究表明，在杂交、免疫能力正常的大型动物中，该方法会导致抗体的发生：这对于血友病而言是无法接受的结果。

这一血友病B的初步经验为其他遗传性疾病的肌肉内基因递送类似设计的临床研究铺平了道路。这些研究表明，根据所需的表达水平和递送基因产物的分泌需求，肌肉内注射可能对某些应用是足够的。例如，阿姆斯特丹分子治疗公司的研究人员使用肌肉内注射AAV1载体表达LPL的天然变异体，探索了一种治疗LPL缺乏症的新方法。尽管三酸甘油酯水平的降低似乎只是暂时的，该团队已经初步报告了超过25名受影响患者中胰腺炎发作次数减少的结果。这些研究还值得注意的是在向受试者进行短期免疫抑制治疗（见下文）；这种方法在未来可能会有更广泛的应用。另一组正在评估肌肉内注射AAV1载体作为α1抗胰蛋白酶缺乏症的新治疗方法，他们报告称，尽管小鼠中相似剂量的治疗效果显著，但剂量高达约1 × 10^12 vg/kg仍然只能达到所需治疗效果的1/200。这些结果表明，对于某些疾病应用，可能需要更高效的传递途径或更高效的表达载体。

递送到更大的肌肉区域

肌肉相关基因递送正在开发中的另一主要疾病群体是肌营养不良症。针对这些疾病的研究已经开创了新的递送方法，可以转导所需的广泛的肌肉组织，从而实现治疗的成功。

Su等人的研究发现，通过应用静水压，可以改变毛细血管后小静脉相邻内皮细胞之间的接触强度，从而使基因载体从循环系统渗透至肌肉组织，并实现安全有效的基因转导。这种方法已在血友病B犬中实现了治疗水平的因子IX表达，而且在非人类灵长类动物中也得到了类似的结果，包括携带微型肌营养不良症基因的基因载体。目前，该方法正在对Becker型肌肉营养不良症患者进行初步测试，尽管目前使用的是盐水而不是真正的基因载体。

尽管有证据表明与肌肉内注射相比，静脉内给予AAV载体的方法不太容易引发针对转基因产物的免疫反应，但全身给药使得载体更容易被预先存在的抗体中和，并且在体内更广泛地分布。

解决衣壳和转基因产物的免疫反应

在基因转导到肌肉中的过程中，避免引发免疫反应对疗效产生负面影响是一个重要挑战。已发表的数据表明，针对AAV包膜的T细胞反应与剂量有关，较高的载体剂量导致循环反应性T细胞在PBMC样本中的比例增加，以及反应性受试者的比例增加。作者实验室在LPL缺乏症的AAV1基因递送的临床试验中进行的研究表明，较高剂量的载体也可能导致包膜特异性T细胞更早地出现在外周血液中，即剂量依赖性可能表现为反应速度加快而非反应强度增加。在AAV1-LPL载体输送过程中同时进行免疫抑制可以阻断3 × 10^11 vg/kg的载体剂量下的T细胞激活，然而，剂量逐步升高至1 × 10^12 vg/kg后，尽管进行了免疫抑制，仍然可以检测到外周血液中的针对包膜的T细胞。

尽管现在已经明确，AAV载体在人体内的使用会导致抗原特异性T细胞的激活，但仍然存在一个问题，即这些反应是否对临床有害或对基因转导的疗效产生负面影响。Two studies associated early detection of capsid-specific T cells with lack of evidence of target tissue transduction in some of the subjects in each series. 包膜特异性T细胞的激活结果可能受到多种因素的影响，包括：转基因本身的免疫调节特性；靶组织中MHC-I的表达水平；靶组织的炎症反应；反应性T细胞的凋亡；以及受试者人类白细胞抗原（HLA）等位基因的变异性。在未来进行AAV肌肉基因转导的临床研究中监测包膜免疫反应将对澄清这些问题至关重要。

最近的一项研究突出了AAV介导的肌肉内基因转导的另一个方面，即细胞免疫反应也可能发生在转基因产物上。通过肌肉内注射，将编码功能性截短版本的dystrophin蛋白的AAV载体递送给肌萎缩症患者。 缺乏长期的转基因表达与检测到的针对mini-dystrophin基因而非患者内源性dystrophin基因的序列的CD8+T细胞反应有关。这些发现凸显了肌萎缩症和其他疾病中的难题，即宿主免疫系统可能阻碍转基因的持续表达，并进一步强调了基因递送临床研究中免疫监测的重要性。

结论和未来展望

病毒载体介导的基因递送可以说是迄今为止最复杂的治疗方法，涉及到DNA和蛋白质两个组成部分。尽管如此，在大约20年的临床研究后，已经取得了治疗成功。这个发展时间表与单克隆抗体类似，并且与骨髓移植相比也有很好的对比。正如我们所讨论的，体内基因转导面临许多组织特异性的障碍。例如，在实现全面在大脑中递送和在全身递送大部分骨骼肌以治疗杜氏肌营养不良方面，存在不同的挑战和策略。对于临床试验而言，也存在着特定组织对风险容忍度的限制。骨骼肌和肝脏可以容忍一定程度的免疫介导的损伤并且仍然可以再生，而脑和心肌的恢复能力更有限。

迄今最成功的例子是通过将基因递送到视网膜下间隙治疗由RPE65基因突变引起的LCA，并且这种方法对于其他遗传性视网膜退行性疾病也具有潜力，只要治疗用的cDNA足够小以适应AAV载体。对于由RPE65突变引起的LCA和其他疾病，该领域需要确定治疗干预的最低、最高和最佳年龄范围，这可能是疾病特异性的。对于更普遍的神经退行性疾病，有希望的结果表明，能够通过向免疫豁免组织的局部区域输送小剂量的载体来改善疾病，帕金森病就是一个很好的例子。然而，要扩大到其他神经退行性疾病的应用，就需要解决全面传递的问题，需要探索新的递送途径和进行载体工程方面的研究。

针对其他目标组织，进展较慢，但也取得了许多有希望的进展。例如，在肝脏方面，对使用AAV8载体表达因子IX的试验的初步结果令人鼓舞，如果能够安全地针对肝脏，这可能为扩大应用奠定基础。此外，肌肉递送方面的技术进展使研究人员在某些疾病（如血友病B和肌营养不良）所需的广泛肌肉递送方面更近了一步。针对基因递送载体和治疗性转基因的免疫反应仍然是未解决的问题，可能存在潜在的安全问题，需要加以解决。

迄今为止，AAV的临床基因治疗研究给我们带来了几个重要经验：疾病阶段对治疗结果的决定至关重要，对于一些疾病来说，早期干预至关关键；在预测AAV介导的基因转导中，小型和大型动物模型对剂量和其他方面的预测非常有用；同时，为了那些尚无有效治疗方法的疾病，我们需要建立严格的自然病史数据库，评估临床相关的终点指标随时间的变化。

对于大多数临床应用来说，还有一些问题需要解决；需要建立符合当前良好生产规范的大规模制造工艺，以及确定载体滴度的标准化方法。此外，还必须解决与AAV载体引起的低但有一定的插入性诱变风险相关的问题。对于某些组织（如呼吸道）的高效基因递送来治疗囊性纤维化和其他肺部疾病（表1），仍需在人体中进行研究。此外，还需要进行额外的研究来确认针对获得性疾病（如风湿性关节炎）的基因治疗的安全性和有效性，已经进行了针对滑膜组织的基因递送的人体研究（表1）。值得注意的是，基因治疗的长期目标是进一步发展超越基因替代的基因组编辑技术，最近使用锌指核酸酶取得了令人鼓舞的进展，这种方法潜在地可以避免插入性突变引起的问题，并在内源性启动子的控制下保留野生型基因序列。

总之，本文所描述的最有希望的结果都是在过去十年中取得的。通过在某些组织中建立了概念验证，并确定了其他组织中存在的问题，该领域很可能能够借助这些经验充分发挥体内基因递送的潜力，为一系列遗传性疾病提供更好的治疗选择。