启动子(promoter)
作用和功能:启动子是指一段能使特定基因进行转录的DNA序列。启动子可以被RNA聚合酶辨认,并开始转录合成RNA。在RNA合成中,启动子可以和调控基因转录的转录因子产生相互作用,控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度,包含核心启动子区域和调控区域,就像“开关”,决定基因的活动,继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。启动子位于控制基因表达的调控序列中、基因转录起始位点的上游(朝向DNA正义链的5′方向),长约100~1000个碱基对。启动子本身并无编译功能,但它拥有对基因翻译氨基酸的指挥作用,就像一面旗帜,其核心部分是非编码区上游的RNA聚合酶结合位点,指挥聚合酶的合成,这种酶指导RNA的复制合成。因此该段位的启动子发生突变(变异),将对基因的表达有着毁灭性作用。启动子代表一些重要的元件可以与其他调节区域(如增强子、沉默子、边界元件或绝缘子)合作一致,以主导基因转录的水平。
分类
诱导型启动子:表达载体采用诱导型启动子,只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响,又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。
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组成型启动子:"能够使基因在所有组织中都能启动表达的启动子称为组成型启动子。组成型启动子的调控不受外界条件的影响,所启动基因的表达具有持续性,但不表现时空特异性。"一般来自于管家基因,可连续不断地启动基因的表达。
- U6 启动子:U6 是二型启动子,一般发现是启动小片段,不带 PolyA 尾的序列。由Ⅲ类 RNA 聚 合酶启动子 U6 启动子转录产生 shRNA,经剪切后产生成熟 siRNA,产生干扰效果。这一类启 动子在腺病毒和慢病毒干扰载体的构建中应用很多。U6 更多的是用在 shRNA 的启动,来达 到敲低一个基因的作用。
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H1 启动子:RNA 聚合酶Ⅲ启动子,H1 RNA 是 RNase P 的一个组分,需在 3’端加上 5 个连续的 T 作为转录终止信号
比较:U6 和 H1启动子都属于真核生物RNA 聚合酶 III 第的三类,shRNA的表达量取决于启动子的强弱,U6 启动子比H1 强,表达持续时间较长,为首选。
CMV 启动子:CMV 是大家公认的启动真核基因表达的最有力量的启动子。相比较 H1/u6 启动子是属于 原核启动子,在真核细胞里面的启动效率非常低。CMV 是三型启动子,长短都可以启动,可以启动 PolyA 尾的序列。一般插入某个基因的CDS 区到 CMV 启动子下游,CMV 负责启动该基因的表达,从而达到调高该基因表达的作用。在腺病毒和慢病毒过表达载体构建中应用最多。
比较:CMV 启动子活性较强,而 U6 启动子则较弱;CMV 启动子和 U6 启动子的转录终止序列不同。当 shRNA 序列有连续 U/T 时应优先考虑 CMV 启动子载体
T7 启动子:T7 启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流,这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选。强大的 T7 启动子完全专一受控于 T7 RNA 聚合酶,而高活性的 T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合酶快5倍——当二者同时存在时,宿主本身基因的转录竞争不过 T7 表达系 统,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白;诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的 50%以上。由于大肠杆菌本身不含 T7 RNA 聚合酶,需要将外源的 T7 RNA 聚合酶引入宿主菌,因而 T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了 T7 系统的调控模式——非诱导条件下,可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录,从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响;通过控制诱导条件控制 T7 RNA 聚合酶的量,就可以控制产物表达量, 某些情况下可以提高产物的可溶性部分。
UBC (泛素启动子):泛素广泛存在于真核生物,对调节细胞内蛋白周转,参与细胞多种生命活动有重要 作用,其在基因家族中的泛素启动子更是在增强基因表达的长期性,稳定性等方面有显著功效。人源性泛素启动子作为一种非病毒性的强启动子,将在基因治疗中起到举足轻重作用。人源性泛素基因家族包括 UbA,UbB,UbC。UbB 和 UbC 相互独立,分别由不同的调节基因调节。UbC 启动子在泛素启动子中属于较强的启动子。
CAG 启动子:CAG 是人工构建的组合启动子,由巨细胞病毒(the cytomegalovirus,CMV)早期增强子(early enhancer element)和鸡 β-肌动蛋白( chicken beta-actin )启动子组成,用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平表达。
组织特异性启动子:只有在特定的器官/组织中才能启动基因的表达,如神经细胞等组织特性启动子,如神经元特异性启动子Syn来源SYN1。