• 免疫浸润在椎间盘退化 （IDD） 中起着至关重要的作用。在这项研究中，我们通过单细胞生物信息学分析探讨了 IDD 的免疫微环境。本研究整合了三个单细胞数据集。根据特征基因将髓核细胞 （NPCs） 分为亚组，通过伪时间轨迹分析分析每个亚组在 IDD 过程中的作用。使用 hdWGCNA 获得枢纽基因，并通过批量数据集和伪时间序列进一步鉴定。枢纽基因的表达定义了与免疫浸润相关的 NPC，并探讨了这些 NPC 与免疫细胞之间的相互作用。NPC 分为四个亚组：储备 NPC、HCL-NPC、反应 NPC 和支持 NPC，它们分别主导 IDD 的四个过程：非、轻度、中度和重度变性。SPP1 和 ICAM1 被鉴定为髓核免疫浸润枢纽基因。巨噬细胞和中幼粒细胞分别通过 SPP1-CD44 通路和 ICAM1-ITGB2 配体-受体通路在 SPP1-ICAM 双通 NPC 组中发挥促炎作用。同时，双方 NPC 都通过 ANXA1-FPR1 通路寻求中性粒细胞的自助炎症缓解。对分化和免疫浸润景观的系统分析有助于了解 IDD 的整体发展过程。我们的数据表明，SPP1 和 ICAM1 可能是治疗 IDD 炎症浸润的新靶点。

直接上结果

1. 本研究的流程图。

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2. 单细胞亚群

集成单细胞数据集的 NPC 亚群的特征。a 所有细胞的主成分分析 （PCA）。b 批量移除后的单细胞分布图。c 来自三个单细胞数据集的 17 个髓核样品的 RNA 质量的小提琴图。d 所有 NPC 的 T-SNE 图，颜色表示不同的亚组。e NPC 亚群基因表达特征热图。f 四个 NPC 亚组的 GO 富集分析的气泡图。

3. 伪时间分析阐明了 IDD 进展的特点

本研究观察到四种类型 NPC 的比例在 IDD 变性过程中有所不同。后备 NPC 在前期占据了主要份额，然后又分为两个分支，其中一个分支仍然以后备 NPC 为主（超过一半），而另一个主要分化为 HCL NPC。随后，它到达了关键的分叉点（红色圆圈），其中一个分支由绝大多数 HCL NPC 组成，而另一个分支继续退化并从 HCL 分化为反应 NPC。大多数响应 NPC 继续退化为辅助 NPC（图 D）。3a-c）。在组织样本水平上进一步检查细胞类型的分布，得出的结果与伪时间分析相似但不完全一致（图 D）。3d）。典型的 IDD 标记基因（如 COL1A1 和 MMP2）的表达呈具有伪时间序列的波浪状，而包括 ACAN 和 COL2A1 在内的健康 NPC 标记基因的表达逐渐降低（图 D）。3e）。这些结果证实了该序列与 IDD 的发展方向一致。

图 3: 伪时间序列揭示了 NPC 亚群分化与 IDD 进展之间的关系。a NPC 的伪时间分析，红色圆圈表示时间轨迹中的关键分叉点。b NPC 的四个亚组的比例分布随序列的进展而变化。c 伪时间序列的每个时期亚群细胞的百分比图。d 显示了不同 IDD 水平的组织水平 NPC 亚组的百分比。e 典型 IDD 相关基因在伪时间序列中的表达变化。f 序列过程中基因表达热图和主要富集 KEGG 通路的聚类。

4. IDD Hub 模块和 Hub 基因的鉴定【这儿用的hdWGCNA】

响应 NPC 在时间轨迹的关键分叉点（图 1 中的红色圆圈）分支出来。3a），这是 HCL NPC 分化为支持 NPC 的过渡细胞亚群。因此，进一步评估了响应 NPC 中的特征模块。使用和声去除批处理效果后，确定了五个特征模块（软阈值 = 4）（图 D）。4a 和 b）。模块 1 （M1） 的 KEGG 通路富集分析显示 TNF-α 信号通路和 NF-κB 信号通路的富集（图 1）。4c）。响应 NPC 中 M1 的和谐模块特征基因 （hME） 值与其他细胞类型显著不同（图 D）。4d），并且 M1 与其他三个模块没有显著相关性（图 D）。4e），表明 M1 在反应 NPC 的炎症反应中是必不可少的。因此，从 M1 中鉴定 IDD 免疫浸润中心基因是合理的，因为ICAM1 和 NFKB1 等炎症标志物都存在于 M1 基因网络中（图 D）。4f）。

图4: 基于hdWCGNA的关键模块识别。 a 响应 NPC 的树状图。 b hdWCGNA 识别的响应 NPC 的 Hub 模块。 c 基于 KEGG 的富集路径气泡图。 d 每个NPC子组中关键模块的表达。 e 模块之间的关联性。 f 来自response-M1模块的代表性基因的网络。

图5: 鼻咽癌免疫相关枢纽基因的筛选与验证。 a 伪时间分析显示hub基因的表达趋势。 b 批量数据集 GSE70362 验证了不同 IDD 水平下 hub 基因的表达水平。 c 以GAPDH为内参，人原代髓核细胞中SPP1和ICAM1的相对mRNA表达水平。 d, e 基于 GSEA 的双上 NPC 与双下 NPC 的富集途径和交互网络。 *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。

5. SPP1和ICAM1双向NPC主要与巨噬细胞通讯

细胞间通讯在决定各种细胞分化命运中起着至关重要的作用。对免疫细胞和 NPC 之间细胞间通讯的分析表明，秘密信号传导和细胞间接触途径是主要的通讯模式（图6a）。对免疫细胞与NPC之间细胞间通讯的分析表明，巨噬细胞（单核细胞）是细胞通讯的关键枢纽，与免疫细胞中的中性粒细胞相互作用密切且最为密切（图6b）。在 NPC 中，双向组细胞主要通过 SPP1 途径进行自分泌通讯。此外，巨噬细胞通过SPP1-CD44配体-受体对通过SPP1途径与双向NPC进行通信（图6c-e）。骨髓细胞通过 ICAM1-ITGB2 通路与 Both-up NPC 进行通信（图6f）。相反，当双上NPC为源细胞时，它们主要通过ICAM途径与骨髓细胞相互作用，其中ICAM1 − (ITGAX + ITGB2)配体-受体对是最重要的（图6 g）。当靶向中性粒细胞时，both-up NPC 主要依赖膜联蛋白途径，其中 ANXA1-FPR1 配体-受体对最为重要（图6h）。

图6: ICAM1 和 SPP1 参与免疫细胞和 NPC 之间的通讯。 a NPC 和免疫细胞之间的细胞-细胞接触网络。 b NPC与免疫细胞相互作用的微环境图。 c–e SPP1信号通路网络。 f ICAM信号通路网络。 g ITGB2信号通路网络。 h ANNEXIN 信号通路网络。