1. 简介
Kraken2是一个基于k-mer算法的高精度宏基因组序列分类软件，能够快速的将测序reads进行物种分类。
Bracken (Bayesian Reestimation of Abundance with KrakEN)是一种高精度统计方法，结合Kraken可以实现高准确度的宏基因组测序数据物种分类分析。
Kraken和Bracken的更多介绍可以参考：宏基因组序列物种分类之kraken 1/2和Bracken的使用
2. 软件安装和数据库下载
Kraken2安装
# 源码安装
git clone https://github.com/DerrickWood/kraken2.git
cd kraken2
sh install_kraken2.sh ~/bin/kraken2 # 安装路径（编译后文件存储文件夹）
~/bin/kraken2/kraken2 --help #可加入到环境变量，方便使用
# conda安装（推荐，可以帮忙解决很多依赖）
conda install -y kraken2
kraken2 --help
Bracken安装
# 源码安装（推荐，后续要用到其中的子程序）
git clone https://github.com/jenniferlu717/Bracken.git
cd Bracken
bash install_bracken.sh
cd src/ && make
../bracken -h # 可将bracken加入环境变量方便使用，绝对路径为～/software/Bracken/bracken
# conda安装
conda install -y bracken
brcken -h
数据库下载（第一种方式）
直接下载Kraken官网索引好的数据库。
# 可直接在下载页面下载
# http://ccb.jhu.edu/software/kraken2/downloads.shtml
# MiniKraken2_v1_8GB 包含了细菌（acteria）、古菌（ archaea）和病毒（viral）
# MiniKraken2_v2_8GB 在v1的基础上加入了人基因组（GRCh38）
wget ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/data/kraken2_dbs/old/minikraken2_v1_8GB_201904.tgz
tar zxvf minikraken2_v1_8GB_201904_UPDATE.tgz -C ./ #绝对路径为～/db/minikraken2_v1_8GB/
# Bracken数据库构建
～/software/Bracken/bracken-build -d ~/db/minikraken2_v1_8GB -t 8 -k 35 -l 150 #结束后会在kraken数据库路径下生成database150mers.kmer_distrib
Bracken参数解释：
- -d，Kraken数据库路径；
- -t，线程数；
- -k，k-mer长度，Kraken1默认为31，Kraken2默认为32；
- -l，reads读长。
数据库下载（第二种）
使用命令行下载Kraken数据库。
# 命令行下载数据库（需要时间长）
kraken2-build --standard --threads 56 --db kraken2_db # 标准模式下只下载古菌（archaea）、细菌（bacteria）、人类（human）、载体（UniVec_Core）、病毒（viral）
数据库下载（第三种）
下载序列后本地索引，较为灵活但下载时间较长。
mkdir kraken2_db && cd kraken2_db
# 先下载taxonomy
kraken2-build --threads 56 --db ./ --download-taxonomy
# 然后下载所需类型数据库序列
# 可用数据库："archaea", "bacteria", "plasmid", "viral", "human", "fungi", "plant", "protozoa", "nr", "nt", "UniVec", "UniVec_Core"
kraken2-build --threads 56 --db ./ --download-library bacteria
kraken2-build --threads 56 --db ./ --download-library viral
......
# 最后索引
kraken2-build --build --threads 56 --db ./
补充说明：官方单独整理了一个真核病原菌的数据库，详情可参考EuPathDB。
3. 分析
数据：质控好的PE150（如果为其它长度，Bracken数据库索引的长度也要改变）数据TEST.R1.clean.fq.gz和TEST.R2.clean.fq.gz。
# 第一步，使用Kraken2分析，不使用--use-mpa-style模式
mkdir out
~/bin/kraken2/kraken2 --db ~/dbminikraken2_v1_8GB --threads 56 --report ./out/TEST.report --output out/TEST.output --paired TEST.R1.clean.fq.gz TEST.R2.clean.fq.gz
# 第二步，使用Braken校正
～/software/Bracken/bracken -d ~/dbminikraken2_v1_8GB -i ./out/TEST.report -o ./out/TEST.S.bracken -w TEST.S.bracken.report -r 150 -l S
# 第三步，将Braken的report格式转换成--use-mpa-style格式
# 用Bracken的子程序
～/software/Bracken/kreport2mpa.py -r TEST.S.bracken.report -o TEST.new.report
结果展示
TEST.new.report
KraKen2参数解释：
- --db，数据库路径；
- --threads，线程数；
- --report，注释结果统计报告（每个物种的reads数目）文件名；
- --output，每条reads注释详情输出文件名；
- --paired，输入数据为paired-end数据。
Bracken参数解释
- -d，Kraken2数据库路径（包含Braken对应长度索引）；
- -i，Kraken2的输出文件名（--report的输出文件名），在这里作为输入文件；
- -o，Bracken输出文件（校正详情）文件名；
- -w，Bracken计算后的新报告（每个物种的reads数目）文件名；
- -r， reads长度；
- -l，分类水平（D,P,C,O,F,G,S）。
kreport2mpa.py参数解释：
- -r，需要转换的报告文件名；
- -o，转换后的报告文件名（--use-mpa-style格式）。
