引物设计是分子学实验的基础了，现在很多软件都是直接输入DNA序列后得到引物，一般情况下，这些引物的效果也都很好。可是当出了意外时还是需要判断引物是否有问题的。
自己这边平时会做一些SNP和MSI位点验证的项目，引物设计时一直使用Primer3.0的在线引物设计。使用它主要的原因是可以在线快速生成引物，根据实验需求选择物种、产物长度、引物长度等参数，整个设计过程快速方便。先把它分享下：
Primer3.0在线引物设计：https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/；
一般情况下，只需设置这三个地方就好了。如果有其他的高级要求，可以自行研究下其它的选项功能。
自己这边已经使用该网页设计了上千对引物，90%以上的引物扩增结果都挺不错。不过最近连续2对引物扩增结果出现了双峰，所以在这里又总结了下PCR引物设计的原则，结合该原则又调整了新的引物进行扩增，目前看效果还不错。有关PCR引物设计的原则，我觉得如下内容还是比较全面的：
**1. 引物的长度**：设计引物的目的是要提高PCR的特异性。因此，这就要求引物与模板DNA中的靶序列以较稳定的形式互补结合。寡聚核苷酸的长度越长，获得的特定靶序列的特异性就越好，引物过短则会影响PCR的特异性。然而，引物过长会使延伸温度超过耐热DNA聚合酶的最适温度，也会影响产物的特异性。因此，引物的长度应适宜，一般要求18~25bp，一对引物中两个引物之间的长度差异应小于3bp。
**2. 基本成分**：G+C的含量一般为40%~60%。四种碱基应随机的分布，避免碱基堆积的现象。尤其引物的3’端，不应有连续的3个G或C，否则会使引物与核酸的G或C富集区互补从而影响PCR的特异性。
**3．引物自身**：引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp的自身互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构，将影响引物与待增DNA中的靶序列的杂交结合。
**4. 引物之间**：引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠以免形成引物二聚体。由于PCR反应体系中含有高浓度的引物，即使引物之间存在极为微弱的互补作用也会使引物相互杂交，最终得到引物二聚体的扩增产物。若引物二聚体在PCR反应的早期形成，它们将通过竞争DNA聚合酶、引物及四种单核苷酸从而抑制待增DNA的扩增。通过精心设计引物、应用热启动PCR(hot start PCR)或者降落PCR(touch down PCR)及特制的DNA聚合酶，可以减少引物二聚体的生成。
**5. 3’末端**：引物的3’端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对。**四种碱基引起的错配有一定的规律，以引物3’端A的影响最大**；另外，引物3’末端碱基错配时，不同碱基的引发率存在很大差异，当末位碱基为A时，错配的引发率大大降低，而当末位碱基为T时，错配的情况下也能引发链的合成。因此，**应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。引物3’端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定**。
**6. 5’末端**：引物的5’端并无严格的限制，在与模板结合的引物的长度足够的前提下，其5’端碱基可不与模板DNA互补而成游离状态。通常这些序列对寡聚核苷酸引物与模板的结合的影响并不显著。因此，引物的5’端可以被修饰，如附加限制酶酶切位点、引入突变位点、标记生物素、荧光物质、地高辛等，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。在后续的扩增循环中，这些与模板未配对的序列将被带到PCR产物的双链中，故在其PCR产物中，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。
**7****. 溶解温度**：**3’端引物和5’端引物应有相似的Tm值，其差别不应大于5℃**。扩增产物与引物的Tm值的差别应小于10℃，以确保PCR循环中的扩增产物有效的变性。
**8. 引物的特异性**：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个碱基同源。
**9．引物的简并性**：引物的3’端应为保守的氨基酸序列，即采用简并密码较少的氨基酸如Met、Trp，且要避免三联体密码第三个碱基的摆动位置位于引物的3’端。
总结：
基本上参考以上原则，设计的引物都没有什么大问题。我们在设计引物时要知其然，知其所以然，这样设计的结果才能比较稳。需要注意的是，不要盲信软件的设计结果，因为软件本质上也只是“依据引物设计的基本原则，逐项设置筛选条件，并按照各项的符合结果赋予分值（有加分原则和扣分原则），最后把结果按照分值进行排序”，所以一方面软件的质量需要有保证（要考虑到尽量全面的因素），我们需要带着怀疑精神去审视各个软件；另一方面，即使是基本原则，也不能保证百分百地扩增全部，一些额外的影响因素是需要我们逐步积累经验的，有心者可以把自己设计过的引物、扩增的体系和仪器设置条件的各个因素多统计一下，摸出自己的心得，就可以在PCR体系调整方面做得得心应手了。
2024.3.10
