引物设计是分子学实验的基础了,现在很多软件都是直接输入DNA序列后得到引物,一般情况下,这些引物的效果也都很好。可是当出了意外时还是需要判断引物是否有问题的。
自己这边平时会做一些SNP和MSI位点验证的项目,引物设计时一直使用Primer3.0的在线引物设计。使用它主要的原因是可以在线快速生成引物,根据实验需求选择物种、产物长度、引物长度等参数,整个设计过程快速方便。先把它分享下:
Primer3.0在线引物设计:https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/;
一般情况下,只需设置这三个地方就好了。如果有其他的高级要求,可以自行研究下其它的选项功能。
自己这边已经使用该网页设计了上千对引物,90%以上的引物扩增结果都挺不错。不过最近连续2对引物扩增结果出现了双峰,所以在这里又总结了下PCR引物设计的原则,结合该原则又调整了新的引物进行扩增,目前看效果还不错。有关PCR引物设计的原则,我觉得如下内容还是比较全面的:
**1. 引物的长度**:设计引物的目的是要提高PCR的特异性。因此,这就要求引物与模板DNA中的靶序列以较稳定的形式互补结合。寡聚核苷酸的长度越长,获得的特定靶序列的特异性就越好,引物过短则会影响PCR的特异性。然而,引物过长会使延伸温度超过耐热DNA聚合酶的最适温度,也会影响产物的特异性。因此,引物的长度应适宜,一般要求18~25bp,一对引物中两个引物之间的长度差异应小于3bp。
**2. 基本成分**:G+C的含量一般为40%~60%。四种碱基应随机的分布,避免碱基堆积的现象。尤其引物的3’端,不应有连续的3个G或C,否则会使引物与核酸的G或C富集区互补从而影响PCR的特异性。
**3.引物自身**:引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp的自身互补序列,否则引物自身会折叠形成发夹结构,将影响引物与待增DNA中的靶序列的杂交结合。
**4. 引物之间**:引物之间不应存在互补序列,尤其应避免3’端的互补重叠以免形成引物二聚体。由于PCR反应体系中含有高浓度的引物,即使引物之间存在极为微弱的互补作用也会使引物相互杂交,最终得到引物二聚体的扩增产物。若引物二聚体在PCR反应的早期形成,它们将通过竞争DNA聚合酶、引物及四种单核苷酸从而抑制待增DNA的扩增。通过精心设计引物、应用热启动PCR(hot start PCR)或者降落PCR(touch down PCR)及特制的DNA聚合酶,可以减少引物二聚体的生成。
**5. 3’末端**:引物的3’端是引发延伸的起点,因此一定要与模板准确配对。**四种碱基引起的错配有一定的规律,以引物3’端A的影响最大**;另外,引物3’末端碱基错配时,不同碱基的引发率存在很大差异,当末位碱基为A时,错配的引发率大大降低,而当末位碱基为T时,错配的情况下也能引发链的合成。因此,**应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。引物3’端最佳碱基的选择是G和C,因为他们形成的碱基配对比较稳定**。
**6. 5’末端**:引物的5’端并无严格的限制,在与模板结合的引物的长度足够的前提下,其5’端碱基可不与模板DNA互补而成游离状态。通常这些序列对寡聚核苷酸引物与模板的结合的影响并不显著。因此,引物的5’端可以被修饰,如附加限制酶酶切位点、引入突变位点、标记生物素、荧光物质、地高辛等,加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。在后续的扩增循环中,这些与模板未配对的序列将被带到PCR产物的双链中,故在其PCR产物中,既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。
**7****. 溶解温度**:**3’端引物和5’端引物应有相似的Tm值,其差别不应大于5℃**。扩增产物与引物的Tm值的差别应小于10℃,以确保PCR循环中的扩增产物有效的变性。
**8. 引物的特异性**:引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个碱基同源。
**9.引物的简并性**:引物的3’端应为保守的氨基酸序列,即采用简并密码较少的氨基酸如Met、Trp,且要避免三联体密码第三个碱基的摆动位置位于引物的3’端。
总结:
基本上参考以上原则,设计的引物都没有什么大问题。我们在设计引物时要知其然,知其所以然,这样设计的结果才能比较稳。需要注意的是,不要盲信软件的设计结果,因为软件本质上也只是“依据引物设计的基本原则,逐项设置筛选条件,并按照各项的符合结果赋予分值(有加分原则和扣分原则),最后把结果按照分值进行排序”,所以一方面软件的质量需要有保证(要考虑到尽量全面的因素),我们需要带着怀疑精神去审视各个软件;另一方面,即使是基本原则,也不能保证百分百地扩增全部,一些额外的影响因素是需要我们逐步积累经验的,有心者可以把自己设计过的引物、扩增的体系和仪器设置条件的各个因素多统计一下,摸出自己的心得,就可以在PCR体系调整方面做得得心应手了。
2024.3.10