文献

2023

Nature Genetics

Pangenome analysis provides insight into the evolution of the orange subfamily and a key gene for citric acid accumulation in citrus fruits

课题背景

（1）柑橘亚科包括33个属的210种植物，其中包括柑橘属。许多柑橘属植物在全球范围内栽培，如橙子、柠檬、酸橙、柑橘、葡萄柚和柚子。柑橘的起源地仍存在争议。有五个柑橘亚科的属被认为起源于非洲热带地区；而有29个属原产于东南亚的季风气候区。最近的研究表明，柑橘的起源地可能是喜马拉雅山脚下的东南部区域。然而，还有其他学者认为柑橘的起源地可能是澳大利亚东北部或中国南部。最早的研究认为，柑橘属中的橘子（Citrus reticulata）、柚子（Citrus maxima）和枸橼（Citrus medica）对柑橘的基因组贡献最大，后来的研究也证实了papeda的贡献。 

（2）柑橘属不同物种的柠檬酸含量差异很大，因此产生了广泛的酸味和甜味（非酸味）。有研究表明，与柠檬一样，野生橘子能够积累异常高水平的柠檬酸，并且确定了与柠檬酸积累有关的若干关键基因。

亮点

作者对314份柑橘材料的基因组数据进行了分析，并组装了12份材料的基因组，结合之前发表的6个柑橘属基因组，作者构建了柑橘亚科的泛基因组。 

作者证明了古印度板块是柑橘属的起源区，中国的中南部是柑橘属的主要起源中心，并且证明了PH4基因对于柑橘类果实种柠檬酸积累的核心作用。

结论1 柑橘亚科果实风味的表型变异

Fig 1

柑橘亚科的果实在大小、颜色和风味等方面存在广泛的变异（Fig 1a）。

Fig S1

为了解析柑橘及其近缘物种果实风味的代谢差异，作者对78份柑橘以及7份柑橘的近缘物种进行了代谢分析。通过PCA发现，柑橘和近缘物种的代谢分成明显的两组（Fig S1）。值得注意的是，在近缘物种种几乎检测不到柠檬酸，而在柑橘中，野生种的柠檬酸含量非常高，栽培种存在不同程度的积累（Fig 1b）。

结论2 柑橘亚科的进化关系

Fig 2a

作者分析了314份柑橘亚科成员的全基因组变异，基于四重简并位点构建了柑橘亚科的系统发育树（Fig 2a）。39份柑橘属近缘种位于系统发育树的底部，证实了它们较早的进化起源。通过估计分歧时间，作者推测Clausena, Bergera, Glycosmis, Murraya, Luvunga 和 Aegle 可能在印度板块和亚洲板块碰撞之前就存在于印度板块上。

Fig 2b

对柑橘亚科祖先分布的重建于柑橘近缘物种在印度板块的祖先位置一致（Fig 2b），这表明古印度板块是柑橘亚科的起源区。

柑橘属275份材料中的3个野生种C. ichangensis, C. mangshanensis 和 C. trifoliata位于进化树的基部，它们被认为是早期分化的柑橘，它们与柑橘属其他物种的七篇、果实和种子存在明显的性状差异。其余柑橘属材料被分成三组，命名为group1-3 （Fig 2a）。

Group1包括C. reticulata和来自中国南部的野生种C. linwuensis.

Group2 包括C. maxima (pomelo), C. medica (citron) 和它们的近缘种，主要来自喜马拉雅山东南部的山麓 (简称SFH)。

Group3 在group2的基础上明显分开，包括C. hindsii和澳大利亚和巴布亚新几内亚的物种。

结论3 柑橘的起源

Fig S8

为了进一步研究柑橘的起源，作者计算了所有材料的全基因组杂合度，以检验杂交起源的可能性。作者发现C. trifoliata、C. mangshanensis、C. linwuensis、Citrus ryukyuensis、C. hystrix、C. hindsii、Citrus hongheensis、Citrus indica、Citrus australis、Citrus australasica、Citrus glauca和Citrus polyandra的杂合水平与基本的柑橘属物种相似（Fig S8）。

Fig S9

Fig S17

假设当前柑橘的地理分布反映了8-9百万年前的生物地理学分布，基于系统发育分析和祖先地理分布的重建（Fig 2b），作者推测中国华南地区（SCC）是许多野生柑橘物种和柑橘的主要起源中心。

作者提出，SFH是“pomelo–citron”类群（group2）的起源中心，因为这个类群中的大多数物种可以在SFH找到。在云南省临沧发现的柑橘化石的叶子形状更类似于C. maxima，而不是其他物种的叶子。此外，C. hystrix类群中新发现的一种papeda，它是group2的一个早期分支，部分类似于pomelo的果实和C. hystrix的叶子。

结论4 柑橘亚科的泛基因组分析

Fig 3a-b

为了进一步探索柑橘亚科的基因组景观，作者为6种柑橘和6种柑橘的近缘种组装了参考基因组。Contig N50在1.6-16.8Mb之间，基因组大小从217.8-419.1 Mb不等。对于Atalantia buxifolia 和 C. linwuensis，作者进一步利用Hi-C数据将contig锚定到9个假定的染色体。对这12份参考基因组以及之前发表的6份柑橘属基因组构建了泛基因组。

18个基因组共鉴定出34,564个orthogroup，其中35.8%存在于17个以上的基因组（称为核心和软核心基因家族），55.4%的存在于2-16个基因组中（称为必要基因家族），8.8%的存在于单个基因组（称为特殊基因家族）（Fig 3a）。物种特异性的基因功能可能反映了该物种独特的生物学特性。通过比较外显子数量、核苷酸多样性和Ka/Ks比例发现核心和软核心基因表现出明显的保守性。随着基因组数量的增加，总的orthogroup数目不断增大，并最终进入平台期（Fig 3b），这些数据表明该泛基因组涵盖了柑橘亚科的大部分基因。

Fig 3c

在柑橘的近缘物种中鉴定到333个扩张的基因家族和401个收缩的基因家族。扩张的家族主要与类黄酮的生物合成以及发育和繁殖相关，收缩的基因家族主要与防御反应相关（Fig 3c）。

结论5 solo LTR有助于基因表达变异

Fig 4a-b

LTR-RTs是柑橘基因组中最丰富的转座子类型，其含量与基因组大小存在显著的正相关（Fig 4a）。

Fig S21

在C. linwuensis、C. changensis和Citropsis gilletiana中发现了LTR-RTs的极度扩张，在一定程度上解释了三者较大的基因组（Fig S21a）。

此外，作者观察到54%-77%的存在与缺失变异（PAVs）来自与转座子，特别是LTR-RTs（Fig 4b，Fig S21b）。

Fig 4c-d

作者对这16个基因组进行了LTR-RT的进一步注释，发现solo-LTRs比LTR-RTs多得多（Fig 4c）。作者进一步分析了solo-LTR和LTR-RTs邻近的基因表达情况，作者发现solo-LTR影响的基因表达量显著高于LTR-RTs影响的基因，但是低于未在启动子插入TE的基因（Fig 4d）。

Fig 4e-f

为了研究solo-LTR是如何产生的，并研究它们如何影响基因表达，作者设计了一个杂交实验。之前的研究表明，Ruby基因控制花青素的积累，作者使用在Ruby启动子区域含有LTR-RT的材料与不含LTR-RT的材料杂交，在40个杂交后代中的13份材料中Ruby基因启动子区域检测到solo-LTR的产生（Fig 4e）。

作者检测了杂交后代叶片的Ruby基因的表达，发现启动子区域带有solo-LTR的Ruby基因表达量显著高于缺乏solo-LTR的基因（Fig 4f）。

结论6 柑橘亚科中的结构变异

Fig 5a-b

在柑橘亚科的基因组中检测到42,417-81,033个结构变异，占每个基因组的14.5%-23.8%。其中57.4%的结构变异仅存在与一个或两个基因组中，60.2%的SV与基因区域（包括编码区、内含子、启动子）重叠。转录组测序表明，带有SV的基因的差异表达比例高于不带有SV的基因（Fig 5a）。

根据SV的类型、长度和位置进行合并，共鉴定到399,338个精度较高的非冗余SV，将这些SV整合到参考基因组中，构建了柑橘亚科的graph-based 泛基因组。

Fig 5c

为了探索柠檬酸含量变异的遗传基础，作者将泛基因组的所有变异与柑橘果实的基因表达进行了整合，共鉴定到10,006个gene body或启动子区域带有SV的基因。利用转录组数据比较了这些基因在5份柑橘和3份柑橘近缘物种的表达水平，发现750个基因在柑橘和柑橘近缘物种中存在显著的差异表达，其中182个基因在柑橘中高表达，568个在柑橘近缘物种中高表达（Fig 5c）。

Fig 6a-b

此外，利用不同发育阶段果实的转录组数据，作者鉴定到29个基因的表达与柠檬酸含量高度相关，其中一个是具有R2R3 MYB结构域的转录因子，并于矮牵牛PH4基因同源。于柑橘近缘物种相比，该基因在柑橘中的表达显著上调。对314份材料的PH4基因进行了系统发育分析，发现PH4基因序列在柑橘和柑橘近缘物种中存在较大的差异（Fig 6a）。作者在11种柑橘中的10种中检测到PH4启动子区域存在插入变异，该片段在6种柑橘属近缘物种中均不存在（Fig 6b）。作者还发现了40个分布在PH4 gene body区域的高度分化的SNP，这些等位基因在柑橘属近缘物种中的出现频率存在显著差异（Fig 6b）。此外，PH4中高度分化的非同义SNP的密度显著高于全基因组所有基因的平均值。

结论7 PH4在柠檬酸积累中的核心作用

Fig S30

作者对PH4基因进行了过表达，发现相对于野生型，过表达材料的pH降低，柠檬酸含量上升（Fig S30a-d）。RT-qPCR证实，在柑橘果实中，导致液泡酸化的质子泵编码基因PH1和PH5的潜在靶基因PH4在过表达材料中相对于WT显著升高（Fig S30e）。

Fig 6c-f

作者利用CRISPR-Cas9研究了PH4在早花柑橘（C. hindsii）中的功能（Fig 6c）。四个独立的基因编辑品系的果肉酸度水平显著降低，约为WT水平的1.4%至3.5% (Fig 6d-e)。相应的，质子泵编码基因PH1和PH5的表达水平在PH44编辑的材料中相对于WT显著下调（Fig 6f）。综上所述，PH4促进了柑橘果实中柠檬酸的积累。

结论8 柑橘近缘物种中PH4对PH5的激活降低

Fig 7a-c

PH4主要在果肉中表达，并且柑橘近缘物种中的表达量明显低于柑橘（Fig 7a）。与AN1相比，PH5的表达模式于PH4更相似（Fig 7a-c）。

Fig 7d-i

作者通过LUC和EMSA检测了PH4和AN1是否能直接调节质子泵编码基因PH5。虽然观察到在p35S:AN1存在和空载（EV）对照下，CitPH5启动子的转录没有显著差异，但作者发现CitPH4的表达足以诱导CitPH5启动子的转录增加。重要的是，与对照相比，CitPH4和CitAN1效应子的共表达进一步增强了来自CitPH5启动子的转录（Fig 7d）。EMSA分析证实了CitPH4和CitPH5启动子之间的结合复合物（Fig 7e）。

Buxifolia是一种柑橘的近缘物种，表达低水平的AbPH4和AbPH5(Fig 7a,c)，即使AbAN1编码序列完整且高水平表达(Fig 7b)，也能产生无酸的果实。在A. buxifolia中，作者在一个AbPH5等位基因的启动子中检测到包含MYB结合位点的85bp的缺失(Fig 7f)。通过烟叶中的瞬时表达实验表明，A. Buxifolia中PH5启动子上的PH4和PH4-AN1复合物的反激活活性远低于柑橘的CitPH5启动子（Fig 7g）。

此外，, dual-LUC assays表明，添加MBS增加了AbPH5启动子上PH4的反活化活性，而删除MBS显著降低了CitPH5启动子上PH4的反活化活性（Fig 7h-i）。

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