这是一篇拖了一个月的稿子。我要晒出事情始末。
初见，因为一句话被吐槽8遍
其实我是10月13号刚认识果子师兄，他来北京做线下培训，我就去凑热闹了。北京那几天比较冷，我好心提醒他多穿衣服。
也不知道，就那么热吗，他私下里吐槽我就算了，居然讲课的时候还公开吐槽我三次！幸亏我没什么知名度。。。难道是亲和力太强，刚认识就忍心这么摧残我TOT，洲更和云晓为证，这个人太阔怕了。
自己挖坑
一个月前，10月17号公众号开通了实验专栏，我不知道哪根筋不对发出了如下留言：
从此开启了一段被催时光
正文开始
原料：某基因的mRNA序列，含有该基因的组织或活体。
目的：得到该基因表达的蛋白。
如图，DNA转录产生mRNA,mRNA翻译产生蛋白质。
这是在生物体内的过程，但想要验证功能，就必须得到单一、纯净的某个蛋白。
一般思路是从活体分离，但实际上分离很困难。用大肠杆菌进行体外表达是可行的方法（选择大肠杆菌是因为原核生物繁殖快，大肠杆菌是常用的原核模式生物）。
整体思路
（1）提取RNA，反转录得到cDNA，PCR得到目的基因
（2）连接到克隆载体，测序得到正确的目的基因序列
（3）连接到表达载体，得到用于原核表达的重组质粒
（4）转化入用于表达的菌株。
（5）菌株扩繁，诱导表达蛋白。
（6）蛋白从细胞中分离出，进行纯化。
顺利的话这基本上是一个月的工作量，很多步骤没有详细写，附上几份文件供大家参考，在果子学生信公众号后台回复”冻死你“即可获得。
一切的开始
一切的开始，是某个基因的mRNA序列，可以是从自己测的转录组/基因组中鉴定出来的，也可以是从数据库（如NCBI）中查到的，根据基因名或登录号可以查找到基因的详细信息，其中就包括mRNA序列和对应的蛋白序列。
有了“纸上”的序列，要把它变成实体核苷酸，再变成大肠杆菌中的质粒，经过一次次死死活活再变成蛋白。
认识克隆载体和表达载体
克隆载体如T3，用于扩增，随着大肠杆菌的分裂而复制，得到更多的目标序列。
表达载体如pet30a(+)是用于表达蛋白，存在于表达载体上的序列，在合适的大肠杆菌中，经IPTG诱导即可表达蛋白。
1.从组织到核苷酸
先提取目标组织的全RNA，其中就包括了mRNA。反转录产生cDNA，cDNA 为模板，根据核苷酸序列设计引物，进行PCR。注意：如果序列有信号肽，需要先去掉信号肽再设计引物。
PCR模板是cDNA，引物是根据mRNA序列合成的，带有酶切位点序列。例如：
PCR引物设计避坑指南
已知序列的基因想要克隆全长，设计引物步骤很简单，就是序列的前后各截取一段（3’端需要用反向互补序列），然后网站预测其TM值，调整氨基酸数量，前后引物TM值差控制在2以内，总的TM值在50-65之间即可。属于最简单的引物设计。然后添加酶切位点，注意酶切位点的几个碱基是不计入TM值的。
微信不能加外链，就这样打出来吧。
https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/tm-calculator.html
但是引物设计有几个坑需要避开。
(1)每种内切酶有对应的酶切位点，要在表达载体的质粒图谱上寻找。
（这个文件我也给出来了。）
(2)保证自己的序列中没有与酶切位点相同的片段
否则会把自己的序列切断（这个很简单，就用记事本打开你的序列txt，ctrl+F查找酶切位点那段序列就可以啦）
(3)避免翻译错位
另外，从起始密码子ATG开始向后数，三个一组，保证自己序列的前三个碱基在同一组，如果不是一组，就要对应补加1或2个碱基，使其成为一组。这个如果错了，后面很难察觉，会导致无法挽回的失败。
PCR产物要用琼脂糖凝胶进行检测，然后胶回收（此处依靠试剂盒）得到目标序列，但此时条带中的序列有成千上万，它们并非完全正确，可能存在突变，需要进行单条序列的分离—方法就是：连接转化
2.连接到克隆载体
T3是一个常用的克隆载体。适用于引物有酶切位点的情况（黏性末端），对应的抗生素是卡那霉素。如果序列太长或不易成功，需要先用不带酶切位点的引物进行PCR，连接到Blunt载体（平末端），然后以此重组质粒为模板，用带酶切位点的引物再次PCR，产物连接到T3载体。
关于连接转化，说明书会介绍的非常详细。只说实现的结果：将序列连接到克隆载体T3，使其进入到大肠杆菌中，通过挑斑分离单条序列。再说点说明书里没有的东西：
大概是我们的试剂太好，并不需要进行蓝白班筛选，基本上挑的斑都会成功。每个单独的斑都是同一个细胞繁殖而来，一个斑就代表了一个单独的序列。
3.连接到表达载体
测序公司可以直接返回测序正确的重组质粒，直接用于下一步--双酶切。这里的双酶指的就是引物设计中带有的酶切位点对应的限制性内切酶（好绕口）
是的，克隆载体对应的常用细胞是trans-T1或DH5α，表达载体对应的常用细胞是BL21或Rosetta。
4.IPTG诱导的目的基因原核表达
将装有将少量菌液接入到新鲜培养基，放入离心管在摇床（37℃，200rpm）摇几个小时，就获得了更多的菌液。给个图片感受一下：
诱导表达需要摸索条件，如果蛋白稳定性不强，需要低温诱导。常用的条件有37℃、28℃、18℃,温度越低需要的时间越长，每个蛋白各有不同，需要摇小瓶探索条件。
几小时后。。。
这么大的体积，怎么收集菌体呢？有一个洗衣机那么大的离心机可以干这个。他的离心瓶体积是1L（我为了写这个推文特意拍的！）
巨无霸长这个样子：
通过这一步有生命危险的离心，就收集到菌体了。上清倒掉，用30mlPBS重新悬浮沉淀（菌体）。就完美实现了体积缩小（真的是有生命危险，每次都很紧张）。
听说可以用发酵罐，也听说很容易被污染。没人教我。好吧，我投降，就这样摇啊摇挺好的呢（苦笑.jpg）
5.从菌体到粗蛋白
此时蛋白是包裹在菌体里的，要想将蛋白释放出来，就要把细胞膜（sui）破（shi）坏（wan）掉（duan）方法就是：
超声波破碎
破碎后再次离心，即得到上清和包涵体。
此时蛋白可能存在于上清中，也可能存在于包涵体中。如果存在于上清则可以直接纯化，如果存在于包涵体，就需要进行变性-复性处理，使其溶解再进行纯化，一般使用盐酸胍方法。
这种方法在论文中通常不详细写，操作步骤很难找，所以我很贴心的放进了文件列表。亲手整理，付出了心血，希望大家尊重我的劳动成果，不要贴出去赚什么积分什么钱。
6.蛋白纯化
纯化方法很多，亲和层析是常用的一种。
（这张图来自GE的蛋白纯化手册，在文件中给出了。）
原理就是镍柱与His标签的特异性结合。His标签在表达载体上，也就加到了目的蛋白里。所以，镍柱和目的蛋白结合，而杂蛋白被冲走。这个过程称为上样-流穿。但是，结合在镍柱上的目的蛋白并不能直接用啊，需要把镍柱和目的蛋白分离开。
这里就用到了另一神奇物质：咪唑。它的特点：低浓度的咪唑不能冲下目的蛋白，高浓度的咪唑可以冲下目的蛋白。所以用浓度逐渐提升的咪唑溶液洗脱，就可以分离镍柱与目的蛋白。
使用的仪器是
可以自动化实现亲和层析。
6.纯化后处理
洗脱液用50ml离心管接收，那么得到的就是十几二十管的目的蛋白。此时有两件事需要做，一是找出目的蛋白存在于那些管，将其体积浓缩--SDS-PAGE检测和超滤；二是除去咪唑、（如果是包涵体还有盐酸胍处理液）等溶质--透析，获得纯净的蛋白（含标签）。
超滤
超滤管是一个嵌套的50ml离心管（也有其他规格），里面的膜有截留作用，能够留下大分子蛋白，过滤掉小分子（主要是水，但并不是全部被过滤掉）。离心过后留下上层溶液，完美实现了体积浓缩。
透析
原理是--半透膜
将蛋白封装在透析袋中，透析带放进装有5L的PBS的大桶，放在搅拌仪上4℃搅拌过夜，此时小分子溶质就会分散在整个5L体系里，被稀释到一个极低浓度，低到忽略不计，而蛋白由于无法透过半透膜，还乖乖留在透析袋里，完美实现了去溶质。
7.His标签切除
标签是为了纯化而添加的，纯化过后我们要过河拆桥，得到原始的蛋白。一物降一物，切除His标签的酶是肠激酶。这样就得到了可以用于功能验证的蛋白溶液。
这是一套理论思路，其中有很多坑，说多了都是泪。诱导失败，蛋白与柱子的亲和力差，包涵体处理失败，挂柱子蛋白凭空消失，透析时出现白絮，甚至肠激酶切不成功，出现模糊带等等，前途是光明的，道路是非常崎岖的。
我的任务终于完成了，我再也不会被催了，哦耶。附件列表送给大家。
