Integrated bioinformatic analysis revealed biological processes and immune cells implicated in autoimmune hepatitis
综合生物信息学分析揭示了与自身免疫性肝炎有关的生物过程和免疫细胞
发表期刊：j cell physiology
发表日期：2021 Feb 17
影响因子：5.546
DOI: 10.1002/jcp.30246
一、研究背景
自身免疫性肝炎（AIH）是一种以慢性肝脏炎症、界面性肝炎、血清免疫球蛋白γ升高和非器官特异性自身抗体产生为特征的免疫介导的肝细胞破坏疾病。因此，非特异性免疫抑制是目前的标准疗法。研究显示，AIH的一个显著特征是肝脏中存在干扰素（IFN）-gamma产生的T-helper 1（Th1）细胞。
作为一种pleiotropic细胞因子，转化生长因子β1在免疫耐受的发展和维持中起着核心作用，并且已经证实它在各种模型系统中具有抑制自身免疫性疾病的能力。在AIH方面，一些研究表明，同种Tgfb1缺失的BALB/c小鼠会自发地、迅速地发生Th1介导的IFN-gamma依赖性坏死性炎症性肝病，从而建立了一个暴发性AIH模型。
二、材料与方法
1 数据来源
GSE9892：野生型（WT）代表野生型小鼠，Tko代表Tgfb1缺失的小鼠，ITko代表Tgfb1和Ifng缺失的小鼠；一个样本取自一只小鼠，每个基因型包含三只小鼠。
2 分析流程
1）差异表达基因的鉴定：使用GEO2R，p <0 .05和│倍数变化|≥1.5
2）功能富集分析：使用Cytoscape与插件CluGO
3）免疫细胞浸润的评估：使用CIBERSORT
三、结果展示
01 - 差异表达基因的鉴定
每个个体的全球基因表达分布以小提琴图（图1a）的形式呈现。为了了解基因表达的改变，进行了三次比较，Tko与WT、ITko与WT、ITko与Tko。与WT组相比，Tko组有2451个基因上调，2894个基因下调；ITko组有2744个基因上调，1929个基因下调。与Tko组相比，ITko组共有2915个差异表达基因，其中1911个基因上调，1004个基因下调（图1b）。图1c-e中分散了每个比较的前50个DEG。
02 - 常见DEGs的功能富集分析
这三个比较产生了516个共同的DEGs（图2a），每个比较之间的DEGs的相互关系见图2b。对这些DEGs进行功能富集分析，GO分析显示，这些DEGs在生物过程中显著富集，包括对干扰素-γ的响应和先天免疫反应的正向调节（图2c）。相互关系分析表明，生物过程可分为几组，其中细胞对细胞因子刺激的反应、免疫反应的调节和先天免疫反应是富集的前三组（图2c）。
为了进一步了解这些常见差异表达基因的作用，我们进行了反应组途径富集分析，结果表明白细胞介素-1信号，免疫应答蛋白的磺酰化，通过ZBP1的放射免疫沉淀介导的核因子κB活化是最显著富集的途径之一，而相关性分析显示CD3和TCR zeta链的磷酸化、免疫系统、磷脂在吞噬作用中的作用、白细胞介素信号、葡萄糖代谢，与趋化因子受体结合的趋化因子是显著富集的途径组（图2d）。
03 - Tko组与WT组的DEGs分析
MA图显示了Tko组2451个上调基因和2894个下调基因的平均表达水平和FC变化（图3a）。对上调基因的GO分析表明，刺激反应的正调控、白细胞活化、免疫系统过程的（正）调控、定位调节和先天性免疫反应是最丰富的生物过程组（图3b）。通过对下调基因的分析发现，富集的生物过程主要分为代谢过程，包括有机酸代谢过程、脂质代谢过程和辅助因子代谢过程（图3c）。
为了增加对上调基因的了解，进一步进行了Reactome通路分析。结果显示，PD-1信号转导、Toll样受体级联、免疫系统中的细胞因子信号转导、干扰素-γ信号转导和基因表达/转录是分类最多的通路组（图3d）。然而，下调基因大多富集在细胞周期、免疫系统、脂类/甾体代谢和生物氧化等途径组（图3e）。
04 - ITko组与WT组的DEGs分析
ITko组2744个上调基因和1929个下调基因的平均表达量和FC变化也通过MA图显示出来（图4a）。上调基因的GO分析将T细胞活化、细胞过程的正向调控、白细胞活化/迁移、细胞因子产生的调控、免疫系统过程的调控归为最重要的生物过程组（图4b）。下调基因富集在生物过程中，主要可分为代谢过程，包括有机酸代谢过程、脂质代谢过程和辅助因子代谢过程（图4c）。
Reactome通路分析表明，上调基因大多富集在Rho GTP酶信号传递、免疫系统、Fc伽马受体依赖的吞噬作用和免疫系统中细胞因子信号传递等通路组中（图4d）。下调基因在脂质/甾体/氨基酸的代谢、化合物的一期功能化、生物氧化剂和免疫系统等途径组中显著富集（图4e）。
05 - 与AIH缓解相关的DEGs分析
在Tko组上调的2451个基因中（与WT组相比），与Tko组相比，ITko组有472个基因下调（图5a）。对472个基因的GO分析表明，这些基因在免疫反应调控方面明显富集，可分为对其他机体的反应、防御反应的调控、免疫系统过程/免疫反应的调控和对细胞因子的反应/调控等组别（图5c）。Reactome通路分析也显示，这些基因主要富集在免疫系统通路中，显著富集的组别包括干扰素信号转导、IFN刺激基因的抗病毒机制、(适应性)免疫系统和葡萄糖代谢(图5d)。
此外， Tko组中下调的586个基因（与WT组相比）在ITko组中上调（图5b）。586个基因的富集分析表明，细胞-细胞信号转导、管发育和神经系统发育是最显著的分类组（图5e）。然而Reactome途径分析表明，细胞外基质组织、含TSR域蛋白的O-糖基化和跨化学突触的传递是富集度最高的途径组（图5f）。
06 - Tko小鼠和ITko小鼠特异性上调基因分析
与WT组相比，Tko组有1141个基因特异性上调，而ITko组有1434个基因特异性上调（图6a）。GO分析显示，Tko组中特异性上调的基因显著富集在生物过程中，主要可分为对细胞因子的反应、解剖结构形态发生、防御反应、免疫系统过程的调控和多细胞机体过程的调控等组别（图6b）。接下来进行了Reactome通路分析，总富集的通路主要可以归纳为免疫系统、免疫系统中细胞因子信号转导、白细胞介素的信号转导、止血、趋化因子受体结合趋化因子（图6c）。
对ITko组特异性上调的基因进行GO分析发现，这些基因大多参与的途径主要可归纳为（有丝分裂）细胞周期过程、有丝分裂核分裂的负调控、（微管）细胞骨架组织、蛋白质定位到染色体、DNA复制独立的核小体组装（图6d）。进一步的Reactome通路分析表明，这些基因显著富集在包括细胞周期、有丝分裂前分裂、核包膜分解、驱动蛋白和Emi 1的磷酸化等通路组中(图6e)。
07 - 分析Tko小鼠或ITko小鼠中特异性下调的基因
在下调基因中，Tko组特异性呈现1713个基因，而ITko组特异性呈现748个基因（图7a）。GO分析表明，ITko组中特异性下调的基因大多富集在生物过程中，可归纳为多细胞生物体发育、细胞通信调节、细胞大分子代谢过程和突触组织等（图7b）。Reactome通路分析表明，这些基因在免疫系统、GPCR信号传递、线粒体翻译终止、磷酸肌苷-3激活的AKT信号传递和细胞对应激的反应等通路组中显著富集（图7c）。
对Tko组中特异性下调的基因进行GO分析，发现这些基因在生物过程中显著富集，主要可分为有机酸/羧酸/脂质代谢过程、细胞对化学刺激的反应以及参与与共生体相互作用的宿主细胞的自噬（图7d）。进行Reactome通路分析，Tko组特异性下调基因的总富集通路主要可分为氨基酸及衍生物代谢、Toll样受体级联、钼辅基生物合成、COPII介导的囊泡运输和糖胺聚糖代谢等（图7e）。
08 - 免疫细胞浸润分析
为了深入了解不同条件下免疫细胞的组成，采用了CIBERSORT。各组的一般免疫细胞丰度如图8a所示。观察到先天免疫和适应性免疫共同调节免疫细胞（图S1）。结果显示，Tko组的T细胞、巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞增加，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、浆细胞和B细胞显著减少（图8a和图S1）。与Tko组相比，ITko组巨噬细胞和NK细胞减少，T细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞增加（图8a和图S1）。
CD4 T细胞是T细胞的主要类型（图8b）。尽管有些变化并不显著，但观察到CD4 T细胞和CD8 T细胞的免疫状态从幼稚转变为记忆的趋势（图8c）。此外，还观察到辅助性T细胞的亚群转移和巨噬细胞的表型转移（图8d和图S1）。
四、结论
总之，利用从可靠的AIH小鼠模型中获得的微阵列数据，作者全面揭示了该疾病所涉及的潜在生物学过程。发现AIH的发展与显著增加的免疫反应和急剧抑制的代谢过程有关。通过估计免疫细胞的浸润，发现了几种类型的免疫细胞的失调。一些免疫细胞的改变与临床发现一致，而其他免疫细胞的改变在AIH中的作用仍未被充分认识。本研究为理解AIH的发展提供了一个新的视角，这将有利于制定针对该病的有效治疗策略。
