简介和前期文章
我对之前的所有教程进行了再次详细的总结
前言：
每当我们接触新事物时，都忍不住问如下图所示之哲学三问（当然有时候问的是，这是什么？可以吃吗？怎么做？）：
由于我们是实验教程，因此便不再详细介绍CRISPR/Cas9的细节，在这里只做一个大概的介绍，主要材料为最近整理的思维导图。温馨提示：如果不需要了解背景知识，可直接跳到第4点，实验方案正文部分。
1. 是何物？
1.1 CRISPR
CRISPR是古细菌及细菌抵抗病毒的机制，当病毒攻击细菌时，细菌将该病毒的部分DNA整合到自身基因内组成CRISPR，当下次该病毒再次来袭之时，CRISPR转录的crRNA可通过碱基互补识别外源性DNA并激活Cas核酸内切酶的DNA切割活性，由此杀伤病毒。
1.2 CAS即为CRISPR相关的核酸内切酶，有多个亚型
1.3 CRISPR/Cas系统
### 2. 有何用
2.1 在细菌中主要抵抗外来病毒的侵袭，略；
2.2 在实际应用中，设计特异性的CRISPR识别片段，可帮助靶向编辑基因，具体可见下图，详细机制可参考张峰组论文：[Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system]
(https://www.nature.com/articles/nprot.2013.143)
3. 如何用
在这里我们使用CRISPR/Cas9直接敲除为例，介绍实验方案和过程，如想更详细了解，可查阅上文提到的张峰组论文：[Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system]
(https://www.nature.com/articles/nprot.2013.143)
根据上文我们已知，CRISPR/Cas系统一共有CRISPR和Cas9两个部件组成，因此：
4. 实验方案正文
CRISPR/Cas9的实验方案有很多种，但最终目的都是一样的，即将靶向结合到目的基因的sgRNA及Cas9核酸内切酶导入到细胞中，达到基因编辑的效果。
根据sgRNA及Cas9的产生、投递方式的不同，有诸多不同的实验方案。在这里我的方案是，将sgRNA插入到含有Cas9的质粒中，将质粒转入细胞，让细胞同时表达sgRNA及Cas9，达到基因编辑的效果。
4.1 确定靶基因--因人而异
4.2 gRNA设计（特异性识别靶基因的序列）-- 0.5 h~半天
这里以非常常见的P53基因为例子，过一遍gRNA设计流程。
（1）NCBI网页下载P53基因序列
点击GenBank
下载序列
（2） 用SnapGene软件打开序列， 分析敲除位点。
敲除所有剪接体共有的外显子序列
鼠标悬停目标外显子，查看详细信息，得知第一个segment（片段）是从12417-12498，一共82 bp；在Sequence中查看，复制一整个segment的碱基序列
segment碱基序列atggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatg
（3）设计sgRNA
一般选择网页工具设计即可： https://zlab.bio/guide-design-resources （张峰实验室），打开网页，选择网页工具--博德研究所
粘贴序列，选择化脓性链球菌（NGG）即Cas9，人类基因组
查看结果
对结果进行判断，选择合适的序列：
![img]
小彩蛋
快捷方案：可以购买已经合成好的sgRNA+质粒（土豪请随意）
寻找现成的CRISPR/Cas9敲除细胞系，在信息介绍中找到公司使用的gRNA，例如：
以上我们完成了对CRISPR/Cas9的简单了解及gRNA的在线设计，由于篇幅较长，将在下一次补充gRNA设计之后的验证事项和质粒构建的方案，感谢关注，继续学习，拜拜~
