为什么选择空间转录组

1. 单细胞转录组分析局限性

• 实验组织要求分离完整且存活，导致一些研究对象被该技术拒之门外。

• 细胞分离过程中的应激，死亡，聚集等现象致使其结果产生偏差。

• 对组织的细胞分离，破坏其空间结构，一定程度上影响了细胞类型和功能的分析。

2. 空间转录组的技术优势

• 任何给定细胞相对于其邻居和非细胞结构的位置，都可以为定义细胞表型、细胞状态，以及最终的细胞和组织功能提供有用的信息。虽然内分泌信号在宏观尺度上起作用，但许多其他类型的信号通过细胞-细胞相互作用或通过附近的可溶性信号作用于邻近细胞。这些信号的一种形式是细胞表面结合蛋白受体和配体对，其mRNA可通过转录组学进行检测。
• mRNA的亚细胞定位决定基因功能，例如调节蛋白质产物在细胞中产生和运输的位置，影响了估计70%的转录物种。这些推断是通过靶向筛选特定的mRNAs得出的，但超出了scRNA-seq的当前能力。新兴的空间转录组学技术有望以亚细胞分辨率同时分析数百至数千个基因。

空间转录组分析平台

空间转录组学旨在统计组织中不同空间位置的基因转录数。不同的技术具有不同的技术参数。模型生物的组织大小可从小（<1mm2）切片到完整器官切片不等；计数的基因数量可以从几十到几千，甚至整个基因组；空间位置可以从整个组织域，到大的500μm×500μm感兴趣区域，再到单个细胞甚至更精细。在当前技术中，基因数量和技术效率之间往往存在权衡，即成功计数的感兴趣转录物的比例，从接近100%到低至1%。

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1. 基于成像的空间转录组技术

• 通过显微镜原位成像mRNA，是基于成像的空间转录组学技术的基础。

• 当对mRNA进行原位成像时，还必须有一种方法来区分不同的mRNA种类，其中有两种。

  1. mRNA的杂交荧光的基因特异性标签，被称为原位杂交（ISH）。

  2. 扩增mRNA的原位测序（ISS），其中转录物通过连接测序（SBL）技术在组织块或切片内直接测序。

• ISH方法

原位杂交平台通过显微镜检测以定量转录。该技术的早期步骤始于20世纪60年代，

1969年通过互补探针标记核酸，1973年标记特定序列，70年代末荧光标记。这种原位杂交（ISH）于1989年首次用于整个生物体（果蝇）。

ISH可用于分析组织切片和整个生物体中的基因表达模式，但主要是定性的。1998年出现了一种对探针标记转录物成像的定量方法，即单分子荧光原位杂交（smFISH），其中每个标记转录物通过显微镜显示为单个点。这种变体已经在商业上使用了一段时间，例如RNAscope。基于现代成像的空间转录组学建立在smFISH上。

当前的ISH方法包括seqFISH、seqFISH+和MERFISH。所有这三种都通过采用多轮杂交在smFISH上延伸。

1. seqFISH（顺序荧光原位杂交）使用荧光团的时间条形码，其中相同的探针在不同的杂交轮中杂交，但每次都使用一个不同的荧光，而不是使用gene与荧光团1:1这样的对应方式，因为这样对数千个基因来说不可能实现的。荧光团的组合和顺序是基因特有的。

2. seqFISH+使用一级基因特异性杂交探针，每个探针具有多个结合位点，以杂交二级荧光团标记的探针。在每一轮连续杂交中，将下一个结合位点与荧光探针杂交，并对整个样品进行成像，荧光团序列定义了mRNA种类。seqFISH使用4个荧光团，条形码长度n取决于靶基因的数量，以在体外描绘整个基因组。然而，如果描述了太多的转录本，则在实践中受到光学拥挤的限制。seqFISH+可以使用60个“伪色”（而不是4-5个荧光团）在单个细胞中描绘10000个基因，并在每个杂交轮仅用荧光团标记一部分转录物，避免了光学拥挤。每个伪色由20个单独杂交轮的组合得到。

3. MERFISH（多重误差鲁棒荧光原位杂交）也使用顺序杂交，但不是荧光团序列，而是使用二元编码二级探针的位点序列：荧光团标记或未标记。任何成像技术中的每一轮杂交都有出错的风险；任何转录本出错的风险都会随着每一轮呈指数增长。MERFISH的二进制方法对错误具有鲁棒性，因为它减少了一轮不可调和错误的机会，从而阻止了转录物的识别，因为如果确定了一个意外的序列，则与使用4个荧光团相比，可以更容易地将其纠正为预期的序列。

4. 除了误差之外，一些ISH方法的两个限制是组织轮廓尺寸小，seqFISH+约1mm2，以及重复成像所需的时间。最近的一项技术，增强型电FISH（EEL FISH），在FISH之前，电泳将mRNA从组织转移到玻璃盖玻片上，这浓缩了组织深度（z轴），允许在x/y平面中捕获的图像具有更大的信号强度，并减少了成像时间。这正作为Rebus Biosystems的Esper仪器进行商业化。

5. 最后，EASI-FISH或扩展辅助迭代荧光原位杂交，其使用清除组织的水凝胶扩展来清除厚组织，在使用直接探针杂交到靶mRNA和成像的seqFISH样编码策略之前，可阻断高达300微米厚的组织。因此，该技术提供了组织中基因表达的3D分辨率。最近用于组织中基因表达的3D分辨率的商业技术包括Nanostring的基于CosMx ISH的仪器。

• ISS方法

代替使用的基因特异性探针，而是使用探针在组织中启动和扩增转录物的同时定位1-2个碱基。每个碱基或2个碱基序列连接到不同的荧光团，从而实现可视化和记录，最终导致每个转录物的识别。引物可以是靶向的或非靶向的，通常通过滚圈扩增（RCA）进行扩增，这保留了空间定位。

空间转录组学的第一个例子于2013年发布，之后被商业化为Cartana，随后被10X Genomics收购。Cartana是一种靶向方法，每轮使用一个查询碱基，随后使用非靶向技术，例如荧光原位测序（FISSEQ）和ExSeq（FISEQ与扩增显微镜的组合），每轮两个碱基。最后，STARmap将方法扩展到3D组织块，并通过动态退火和连接（SEDAL）结合1个和2个查询碱基探针，采用误差鲁棒测序和减少误差。然而，z轴上的成像可能需要较长的显微镜时间，特别是如果执行多轮STARmap以描绘同一区块中不同基因的面板。

• 技术限制

ISH和ISS方法是有用的，因为它们具有高的空间分辨率，能够在亚细胞水平上分析mRNA。ISH方法比ISS方法更有效地检测mRNA，因为滚圈扩增可以是选择性的。然而，ISS方法可以检查更大的组织区域，因为RCA增加了信噪比，允许更低的放大率。ISH和ISS方法都受到一些类似的技术限制，特别是需要在显微镜上花费数小时至数天的成像时间，从而生成数TB的数据。最后，这些方法需要在捕获效率与基因数量之间进行一些权衡。ISH方法，如seqFISH，可以计数样本中几乎所有的靶转录物，但分析的基因越多，需要的杂交轮次就越多，复合错误的可能性就越大。相反，ISS方法（如Cartana）需要较低的放大率设置，但RCA效率低下，未扩增的转录物不被计算在内，这意味着捕获效率与下面讨论的测序方法相当。

2. 基于序列的空间转录组技术

• 从组织中提取mRNA，同时保留空间信息，然后通过下一代测序（NGS）技术分析mRNA种类，这是基于测序的空间转录组学技术的基础。

• 保存空间信息的常见方法是（1）基于显微切割的方法，通过显微切割和微流体，直接捕获和记录位置（2）基于阵列的方法，通过将mRNA连接到微阵列中的空间条形码探针来进行空间定位。

• Microdissection方法

早期的先驱技术是激光捕获显微切割（LCM），其中通过微阵列对特定组织区域进行处理以进行转录组分析。2000年代，Tomo-seq对组织进行了冷冻切片，每个切片都进行了RNAseq分析。Geo-seq是相似的，但组织切片要经过scRNA-seq。现代显微切割技术包括Nanostring的GeoMx DSP，其可变空间分辨率低至接近单个细胞，其中用基因特异性可见光切割探针对基因进行条形码阅读。当紫外线照射在组织上时，一次照射一个感兴趣的区域，探针就会被释放并测序。由于LCM过程中激光诱导的mRNA降解，以及独立文库制备物的数量等实际考虑因素，STRP-seq被开发用于在连续的薄切片上以2D方式描述基因表达，然后以不同角度进行横截面并测序以揭示基因表达模式。总的来说，这些基于微切割的技术为分析无偏、空间分辨的转录组提供了有用的第一套技术，但它们受到其空间分辨率、LCM用于微切割时mRNA的降解以及处理许多样本进行测序的需要的限制。

• Arrays方法

相比之下，2016年的空间转录组学（ST）是一个位置条形码、“基于阵列”捕获mRNA的早期例子。将组织安装在阵列上，通过空间条形码探针局部捕获释放的mRNA，转化为cDNA，然后测序。与ISH和一些ISS方法一样，探针不是基因特异性的，而是以非靶向的方式捕获聚腺苷酸化的mRNA。阵列方法的空间分辨率由包含任何给定的唯一位置条形码的捕获区域的大小来定义，这可能类似于摄影中的像素大小。ST具有100μm（中心到中心）的捕获区域或像素。10X Genomics将其商业化，称为Visium，将其分辨率提高到六边形55μm，并计划在2022年实现2μm的捕获区域。其他发展包括Slide-seq，它使用由直径10μm的条形码珠组成的阵列，在组织安装之前确定每个位置的条形码。Slide-seqV2是一种改进了条形码和酶文库制备的版本，其每个捕获珠的转录组信息恢复量是10X基因组学中基于水滴的单细胞转录组信息的30-50%，这意味着每10μm像素可以检测到数百或数千个基因。高清空间转录组学（HDST）的工作原理与Slide-seqV2类似，珠子被限制在载玻片中蚀刻的孔中，空间分辨率为2μm。Stereo-seq等新兴技术实现了更低的分辨率用放置在相距0.5μm的孔中的条形码RCA产品进行标记；Stereo-seq和其他非常高分辨率的测序技术，如PIXEL-seq，每单位面积的mRNA回收率与Visium相似。Stereo-seq目前正在由华大基因作为其STOmics平台进行商业开发，目前处于早期访问阶段。最后，虽然这些技术中的大多数是为储存在低于信使核糖核酸降解温度的新鲜冷冻组织而设计的，但一些方法，如Visium FFPE，与用福尔马林固定并包埋在石蜡中的组织兼容，尽管这需要额外的步骤来制备用于分析的组织，基因特异性探针组（尽管基因组中的所有基因都有图谱）。也有独立开发的将Visium试剂用于FFPE保存组织的技术，但尚不清楚这些技术是否正在积极的商业开发中。

将组织安装到阵列上的另一种选择是使用微流体通道将阵列“打印”到组织上，这是组织中用于空间组学测序（DBiT-seq）的确定性条形码所使用的一种方法。条形码沿着组织切片的一个轴沉积，然后垂直于第一轴。然后将条形码相互连接，以在组织上的每个点产生唯一的条形码。捕获面积取决于所使用的微流体通道的直径，其范围从10μm到25μm或50μm不等。这种方法有利于避免mRNA从局部捕获区域扩散，并通过在处理前在微流体通道中给予寡核苷酸标记的抗体来进行蛋白质评估。

• 技术限制

这些方法的缺点是捕获区域不遵循细胞形态的复杂轮廓。因此，细胞通常横跨多个捕获区域，为一个以上的像素贡献信使核糖核酸。即使捕获区域小于单个细胞（如HDST），它们仍然缺乏单细胞分辨率，因为它们仅从单个细胞大小的区域捕获mRNA。因此，最近的技术，如XYZeq和sci-Space，采用了空间条形码阵列，不是用于mRNA捕获，而是用于完整的细胞标记。然后将完整的细胞解离，并用空间记录的条形码进行scRNA-seq。这些方法中的mRNA回收得益于使用已建立的scRNA-seq技术，sci-Space平均检测约1200个基因/细胞。然而，它们在相对较低的空间分辨率下工作。sci Space使用半径为80μm的光斑，XYZeq光斑的中心到中心距离为500μm。

与ISH和ISS方法相比，array方法具有各种优点和缺点。它们通常描绘更大的组织切片，例如Visium高达6.5毫米×6.5毫米，而seqFISH只有0.5毫米。通过使用NGS而不是显微镜，他们避免了图像处理管道。此外，它们是非靶向的，可以对任何使用聚腺苷酸信使核糖核酸的生物体的整个转录组进行分析。然而，它们的空间分辨率和mRNA回收率低于ISH和ISS方法。最后，通过依赖固定阵列，可以在同一点捕获来自不同细胞的转录物，这意味着需要复杂的分析来确定每个点存在哪些细胞类型。

结束语

本文的大多观点来源于综述：[An introduction to spatial transcriptomics
for biomedical research]（https://doi.org/10.1186/s13073-022-01075-1）。该文详细介绍了空间转录组分析技术的前世今生，以及对未来的期待，其中还包括空间转录组实验设计和下游生信分析的指导建议，如果对其感兴趣，请自行进行下载。同时欢迎大家微信搜索”豫见生信“一起学习。