使用BRAKER2进行基因组注释
BRAKER2是一个基因组注释流程，能够组合GeneMark，AUGUSTUS和转录组数据。
在使用软件之前，有几点需要注意下
- 尽量提供高质量的基因组。目前随着三代测序价格下降，这一点问题不大。
- 基因组命名应该简单，最好就是">contig1"或">tig000001"
- 基因组需要屏蔽重复序列
- 默认参数通常表现效果就很好，但是也要根据物种来
- 一定要对注释结果进行检查，别直接使用
软件安装
BRAKER的依赖软件不少，且Perl需要安装的模块也很多，我们用conda能解决这些问题(需要添加bioconda频道)
conda create -n braker2 braker2
安装结束后会输出一些提示信息，汇总以下就是
- 保证AUGUSTUS的config目录能够有可写权限（自己用conda安装不需要考虑这个问题）
- GeneMark和GenomeThreader还需要额外下载安装
我们一定要安装的就是GeneMark，需要从 http://exon.gatech.edu/GeneMark/license_download.cgi 下载安装，然后添加环境变量
export GENEMARK_PATH=/your_path_to_GeneMark-ET/gmes_petap/
此外还有一些BRAKER2建议的软件，conda没有安装，需要自己按需安装
- DIAMOND 0.9.24: 替代NCBI-BLAST+
- cdbfasta 0.99: 纠正AUGUSTUS预测的开放阅读框内内含有终止密码子的基因
- cdbyank 0.981: 纠正AUGUSTUS预测的开放阅读框内内含有终止密码子的基因
- GenomeThreader: 仅在你需要用蛋白数据进行注释时，才需要
关于这些conda未安装的软件参考https://github.com/Gaius-Augustus/BRAKER#optional-tools
以cdbfasta和cdbyank为例
git clone https://github.com/gpertea/cdbfasta.git
cd cdbfasta
make all
之后可以添加到环境变量
export CDBTOOLS_PATH=/path/to/cdbfasta/
也可以复制到conda建立的braker2的环境中，其中~/miniconda3是我conda的路径
cp cdbfasta cdbyank perltest.pl ~/miniconda3/envs/braker2/bin
安装完成之后，建议现运行下面这一步检查软件依赖
braker.pl --checkSoftware
软件运行
BRAKER根据数据类型，有不同的运行模式，但根据现状其实最常见的情况是测了一个基因组，并且还测了二代的转录组，或许还有一些近缘物种的蛋白序列。因此假设你手头有下面这些数据
- 基因组序列: genome.fasta
- 转录组数据: XX_1.fq.gz, XX_2.fq.gz
- 蛋白序列: proteins.fa
第一步: 屏蔽基因组中的重复序列，这一步参考使用RepeatModeler和RepeatMasker注释基因组重复序列
RepeatMasker -xsmall -species arabidopsis -pa 40 -e ncbi -dir . genome.fasta
#-xsmall: soft-mask
这一步输出的genome.fasta.masked将是后续注释的输入
第二步: 使用STAR将FastQ比对到参考基因组，STAR使用说明参考「RNA-seq分析软件」RNA-seq比对工具STAR学习笔记
mkdir -p STAR
# 建立索引
STAR \
--runThreadN 20 \
--runMode genomeGenerate \
--genomeDir STAR \
--genomeFastaFiles genome.fasta
# 比对
STAR \
--genomeDir STAR \
--runThreadN 20 \
--readFilesIn XX_1.fq.gz, XX_2.fq.gz \
--readFilesCommand zcat \
--outFileNamePrefix xx_ \
--outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
--outBAMsortingThreadN 10 \
--outSAMstrandField intronMotif \
--outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonical
mv xx_Aligned.sortedByCoord.out.bam xx.bam
输入结果为 xx.bam 如果测了多个组装的转录组，为每个样本运行一次比对生成多个BAM文件。
第三步: 运行BRAKER2
braker.pl --cores 48 --species=yourSpecies --genome=genome.fasta.masked \
--softmasking --bam=xx.bam \
--prot_seq=proteins.fa --prg=exonerate \
--gff3
braker.pl最多支持48个线程。
最终会输出蛋白序列和CDS序列以及GFF文件
可能问题
使用conda安装时可能会出现的问题
Error in file bamToWig.py at line 172: Return code of subprocess was 127
原因是因为faToTwoBit程序出错
faToTwoBit
faToTwoBit: error while loading shared libraries: libssl.so.1.0.0: cannot open shared object file: No such file or directory
这是因为conda没能正确处理依赖关系，openssl版本过高，解决方法如下
# 建立软链接
cd ~/miniconda3/envs/braker2/lib
ln -s libssl.so libssl.so.1.0.0
ln -s libcrypto.so libcrypto.so.1.0.0
运行时出现如下警告
OpenBLAS blas_thread_init: RLIMIT_NPROC 4096
无视掉
参考资料
- BRAKER2官方教程: https://github.com/Gaius-Augustus/BRAKER
