题目
High expression of ACE2 receptor of 2019-nCoV on the epithelial cells of oral mucosa
摘要
据报道，ACE2是2019年nCoV的主要宿主细胞受体，在病毒进入细胞引起最终感染中起着至关重要的作用。要研究口腔黏膜上2019-nCov感染的潜在途径，来自两个公共数据库的大量RNA-seq配置文件，包括癌症基因组图谱（TCGA）和基因表达功能注释（FANTOM5 CAGE）收集数据集。为了分析和验证ACE2在口腔粘膜中的表达，分析了TCGA的13种癌旁正常组织和FANTOM5 CAGE的14种正常组织的RNA-seq分析数据。此外，来自内部产生的独立数据的单细胞转录组被用于鉴定和确认表达ACE2的细胞组成及其在口腔中的比例。结果表明，ACE2在口腔粘膜上表达。有趣的是，该受体在舌头的上皮细胞中高度富集。最初，这些发现解释了口腔是2019-nCoV感染易感性潜在高风险的基本机制，并为牙科临床实践以及日常生活中的未来预防策略提供了证据。
方法和材料
公开数据集的获取和分析
从癌症基因组图谱（TCGA; https://www.cancer.gov/tcga）下载。将RNA-seq数据进行批量效应归一化，并进行log2转换以用于后续分析。
内部队列的口腔组织
由于我们先前有关口腔潜在恶性疾病的研究，在获得四川大学华西口腔医院的知情同意并获得伦理学批准后，从患者那里获得了口腔粘膜的四个组织。
新鲜活检组织分离
新鲜的活检组织用D-PBS（Hyclone）洗涤两次，并收集到预冷的MACS组织存储溶液（Miltenyi）中。 使用全皮肤分离试剂盒人类（Miltenyi）制造商指南从活检组织中产生单细胞悬液，并用70μmMACS Smartstrainers（Miltenyi）过滤。 通过红细胞裂解缓冲液（Abcam）裂解残留的红细胞，并通过Easysep死细胞去除（Annexin V）试剂盒（STEMCELL）去除死细胞。 最后，将细胞沉淀重悬于D-PBS中。
单细胞RNA测序
为了生成单细胞乳液中的凝胶珠（GEM），使用10x铬平台捕获细胞并对其进行条形码处理。 将细胞与涂有寡核苷酸的凝胶珠一起分配到GEM中，并扩增带有两个条形码的cDNA，并使用10x Genomics Chromium Single Cell Kit（v3 chemistry）为每个样品构建文库。 将所得文库在Illumina NovaSeq 6000系统上测序。
单细胞RNA-seq数据预处理和分析
FASTQ文件使用Cell Ranger软件套件（版本3.1； 10x Genomics）进行了分析。 使用Seurat（3.0版）读取四个组织的基因条形码矩阵。 为了控制质量，我们删除了<200个基因和500个UMI计数的细胞，以及线粒体含量高于5％的细胞。 此外，滤出了<3个细胞中检测到的基因。 使用Seurat中的“ sctransform”包装器对数据进行规范化并消除混杂的变异源，“ IntegrateData”用于整合来自四个组织的Seurat对象。 使用统一流形近似和投影（UMAP）进行降维和对单元进行聚类，并根据其规范标记分配单元类型。 用Seurat在R中生成UMAP图，热图和小提琴图。
结果
图1。a TCGA癌旁正常组织中ACE2表达的小提琴图。 b FANTOM5 CAGE数据集中正常组织中ACE2表达的条形图。 c TCGA在不同口腔部位的癌旁正常组织中ACE2表达的条形图； d TCGA两种口腔部位中ACE2的箱线图
