一.引物设计的原则:
(1)引物长度一般在15~30 bp之间。
引物长度常用的是18-27 bp ,但不应大于38bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。
(2)引物GC含量在40%~60%之间
GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般低于Tm值5~10℃。
(3)碱基要随机分布
引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3'端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3'端不应超过3个连续的 G或C,因这样会使引物在 GC 富集序列区错误引发。
(4)引物自身及引物之间不应存在互补序列
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
(5)引物的5'端可以修饰,而3'端不可修饰
引物的5'端决定着 PCR 产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。